我国不同地区猪源致泻性大肠杆菌的多重PCR鉴定及2b-RAD序列分析

摘要：为了解我国不同地区屠宰生猪肉品中致泻性大肠杆菌污染情况及系统进化关系，降低由其带来的公共卫生危害，将近几年分离自华北、华东、华中及西南地区猪屠体表面的283株大肠杆菌进行了致泻性大肠杆菌多重PCR鉴定及2b-RAD测序分型。多重PCR鉴定结果显示，共检出36株致泻性大肠杆菌，检出率为12.7%，其中西南地区检出率（26.92%）高于华北（13.33%）、华东（10.57%）和华中（10.81%）地区；5种致泻类型中，产肠毒素大肠杆菌（ETEC）、肠致泻性大肠杆菌（EPEC）、肠聚集性大肠杆菌（EAEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）和肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）的占比分别为33.33%、30.56%、25.00%、5.56%和5.56%。将致泻性大肠杆菌进行2b-RAD测序，种群聚类分析显示，这36株致泻菌可分为8个亚群；系统发生树分析显示，亲缘关系较近菌株的致泻类型基本一致，分离时间也比较接近，而且来自同一地区菌株的亲缘关系相对较近。可见，我国屠宰生猪肉品中污染的致泻性大肠杆菌以ETEC、EPEC和EAEC类型为主，其流行分布有一定的地域差异，且其亲缘关系呈一定的时空特异性。本研究为精准防控生猪屠宰环节致泻性大肠杆菌污染，保障肉品卫生安全提供了科学数据和技术支撑。

大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）是肠杆菌科（Enterobactericaeae）中寄生于恒温动物消化道下段、兼性厌氧的革兰氏阴性杆状细菌，但在特定情况下可致病：一类是细菌寄生部位发生改变，成为机会致病菌；另一类是致泻性大肠杆菌，可引起婴幼儿与成年人细菌性腹泻、呕吐、发热等。根据毒力因子和发病机制不同，可将致泻性大肠杆菌分为5类：产肠毒素大肠杆菌，肠致泻性大肠杆菌，肠出血性大肠杆菌，肠侵袭性大肠杆菌和肠聚集性大肠杆菌。

在过去的40年内，较为严重的致泻性大肠杆菌感染事件均是通过食物传播引起的。例如，美国多次暴发的与肉馅有关的O157:H7食物中毒事件，日本1996年暴发的与进食牛肉有关的大肠杆菌疫情，2020年我国贵州省一所学校发生的200多名学生大肠杆菌食物中毒事件。可见，致泻性大肠杆菌在食源性疾病中扮演着重要角色，目前已成为各国畜禽产品致病微生物监测和控制的重点。猪肉是我国广大居民最主要的动物源性食品，而生猪屠宰环节是肉品受致病菌污染的关键风险点之一。因此，及时监控生猪屠宰环节中致泻性大肠杆菌污染情况，对控制其传播、降低食品安全隐患具有重要意义。

为了解我国不同地区生猪肉品中致泻性大肠杆菌的污染情况及系统进化关系，本研究对近几年分离自华北、华东、华中及西南4个地区生猪屠宰环节的283株大肠杆菌进行了致泻特性鉴定，并通过2b-RAD测序，对阳性致泻菌进行分型分析。

材料与方法

材料

方法

致泻性大肠杆菌多重PCR鉴定。本次检测的5种致泻类型和相应的毒力基因分别为：ETEC-est/elt、EPEC-eae、EHEC-eae+stx、EAEC-aggR、EIEC-ipaH。采用煮沸法提取283株待检菌株的DNA模板，配制2.5%浓度的琼脂糖凝胶，取10μL PCR产物于加样孔中，120V电泳30min，在凝胶成像分析仪中观察电泳结果。

2b-RAD测序。挑取致泻性大肠杆菌单菌落接种至2mL胰蛋白胨大豆肉汤中，置于37℃温箱中培养18h；每株阳性菌各吸取200μL送至青岛欧易生物科技有限公司进行2b-RAD测序。

序列分析。利用软件Structure（verison 2.3.4），对所有测序个体进行种群结构聚类分析；利用软件Treebest（Version 1.9.2），将获得的序列构建NJ（Neighbor-Joining）树，树的可靠性通过bootstrap法进行检验（重复1000次）。

结果与分析

致泻性大肠杆菌鉴定

5种致泻类型和6种毒力基因的PCR阳性结果见图1。本试验共从283株大肠杆菌中鉴定出36株致泻性大肠杆菌，阳性检出率为12.72%。其中，西南地区最高，为26.92%（7/26），华东地区最低，为10.57%（13/123）。这36株致泻性大肠杆菌中，ETEC、EPEC、EAEC占比较高，分别为33.33%、30.56%、25.00%；而EHEC、EIEC占比较小，均为5.56%。具体结果见表1。

种群结构分析

利用软件Structure（verison 2.3.4），对所有测序个体进行种群结构聚类。为挑选合适的N（软件内部称之为K值），依次设置不同的N值进行多次计算。这里，N值依次选用了3~10之间的整数，每个N值做3次重复。根据变化曲线，最终选择N=8时的结果作为种群分析结果。分群结果（图2）显示，研究群体推断由8个亚群组成，即这36株致泻性大肠杆菌可分为8个亚群。

系统发生进化树分析

将获得的序列利用软件Treebest（Version 1.9.2），构建NJ（Neighbor-Joining）树，并对树的可靠性通过bootstrap法进行检验（重复1 000次）。结果（图3）显示：第一，亲缘关系较近菌株的致泻类型基本一致，如1、3、5均为EAEC，13、14均为ETEC，219、280均为EPEC；第二，亲缘关系较近菌株的分离时间大都比较接近，如1、3、5均分离自2008年，80、141、143、196、207分离自2010—2012年；第三，来自同一地区菌株的亲缘关系相对较近，如49、50、51、52均来自华北地区，141、143、196、207均来自西南地区。通过与图2比较发现，以上结果与种群聚类结果基本一致。

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