仿制药体外渗透性研究的应用进展

仿制药体外渗透性研究的应用进展

《中国新药杂志》

2022 年第31 卷第11 期

刘雪婧，李文龙，关皓月，许鸣镝

中国食品药品检定研究院

摘要

关键词

仿制药一致性评价; 渗透模型; 平行人工膜; 生物等效性豁免

当前仿制药一致性评价正在如火如荼地开展,在关注仿制药物和参比制剂的溶出度及其他指标的同时,药物体内外相关性以及生物等效性( BE) 研究也成为一致性评价中被关注的重点?在《ICH 协调指导原则-基于生物药剂学分类系统的生物等效性豁免( M9) 》中也提出需提供药物的高溶解性和高渗透性数据来确定药物的生物药剂学分类( BCS) ,从而申请简化或者豁免BE 试验?药物在胃肠道中的溶解性和渗透性是决定药物吸收程度的关键[1],因此在口服制剂的开发过程中需要进行深入的胃肠道吸收程度研究,这样不但可以预测口服给药生物利用度的大小,还可以预测摄入的食物?人体内环境的pH 值等现实因素对生物利用度的影响,以便为制剂的处方优化?未来上市后药物的BE 豁免等提供依据?在口服药物吸收机制的研究中,药物的渗透性是决定性参数之一[2]?

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药物的渗透性

药物的渗透性是指药物分子通过生物膜的速度,药物的肠道渗透性是指药物跨过肠壁细胞进入血液循环的能力,通常以单位时间或面积通过的药量作为衡量标准,其渗透的机制以被动运输和主动转运为主[1],被动过程经细胞膜( 跨细胞) 或肠细胞间的紧密连接( 细胞旁路) 转运,除此之外也有载体介导的多种泵入和外排机制?药物的肠道渗透性决定了药物被人体吸收的速率和程度,并进一步决定了药物生物利用度的高低?药物渗透性评价基于人体药动学研究吸收程度,如绝对生物利用度( absolute bioavailability) 或质量平衡( mass balance) ?一般认为,当绝对生物利用度不小于85%,或不小于85%的药物以原形药物或以原形药物及代谢物( 吸收后产生的代谢物) 总和的形式从尿液中排出,即可认为药物具有高渗透性?因此药物的渗透性也是一致性评价中需要关注的重点,我们需要采取多种模型预测药物在体内的渗透性,进一步了解药物的本质属性,以此给予药品更加准确的评价?

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药物渗透性预测模型

2. 1 动物在体肠灌流模型

该方法是通过打开腹腔的手术将实验动物体内的目标肠段取出,并在两端插入导管,将药物以一定的流速灌入肠腔,再将流出的液体定时收集,并用分析手段测定药物浓度[1,4]?这种模型还可以细分为在体单向肠灌流模型和闭环肠灌流模型?后者与前者的区别在于通路是否封闭,后者的优势在于可以相对减少灌肠液和药物的用量,较适用于阿替洛尔等低渗透性药物[1]?

屈清慧等[5]采用在体单向肠灌流法研究芍药苷和刺芒柄花苷在大鼠不同肠段的吸收特性,探索复方给药对单一活性成分吸收的影响,得出了十二指肠为芍药苷和刺芒柄花苷的最佳吸收部位?董月柳等[6]通过酚红和地高辛灌流实验分别对肠上皮细胞的紧密连接结构以及P-糖蛋白( P-gp) 表达的完整性进行验证,提出了选择合适的渗透模型能够有效提高对于药物BCS 分类判定的准确性?刘洋等[7]结合多种渗透性研究实验方法对比分析及结合生理药动学模型对苷元成分的人体吸收进行预测,实验结果进一步说明了在体单向肠灌流模型是预测药物渗透性和人体吸收的良好工具?

2. 2 离体肠囊模型

实验过程中如给动物注射的麻醉剂影响药物检测结果时,我们可以选用离体模型代替在体模型,这种模型也可以用于研究药物在不同肠段的吸收情况及药物的相互作用?缺点在于离体条件下肠内酶活力降低,会影响部分药物的渗透性数值,同时因肠黏膜细胞活力限制,整个实验需快速完成,因此取样点也有限,该类模型多用于初步定性研究[1]?此类模型可分为外翻肠囊模型?未外翻肠囊模型和尤斯灌流模型等?吴蕊男等[8]通过用体外外翻肠囊模型对一些药物的跨膜运输进行了研究,并计算了它们的表观渗透系数( P app ) ,证明了药物的P app 与渗透性的高低有关,初步构建了体外评价药物渗透性的模型,以此对不同药物的渗透性进行区分和划定?

2. 3 细胞模型

2. 3. 1 人结肠癌细胞上皮细胞( Caco-2)

我们常用Caco-2 细胞来测定药物的渗透性,用于研究药物双向转运情况,通过考察时间?药物浓度等因素,计算药物的表观渗透系数[4]?被动扩散的药物经此模型测得的渗透性结果与人体较为一致?Caco-2 细胞与小肠上皮细胞在形态上十分相似,具有相同的细胞极性且紧密连接,在小肠上皮细胞中的各种转运系统?代谢酶等在Caco-2 细胞中都有相同的存在[9]?《ICH 协调指导原则-基于生物药剂学分类系统的生物等效性豁免( M9) 》中提及在利用Caco-2细胞检测药物渗透性的同时还应通过在实验前后比较跨上皮电阻( TEER) 测量值和/或其他合适的指标,确认Caco-2 细胞单层的完整性?此外,还应通过已证实的零渗透性化合物证明细胞单层的完整性[3]?

Caco-2 细胞的优势在于同源性好,可用于区分肠腔内不同吸收途径的差别,判断药物吸收的方式,求出药物吸收的药动学参数?然而Caco-2 细胞也有一定的缺点,如缺少肠壁的黏液层?缺少部分代谢酶?屏障特性与结肠上皮细胞类似而与小肠上皮细胞有一定差别?

孟杰等[10]通过建立Caco-2 细胞模型,研究钩藤碱的跨膜运输转运特征及吸收规律?通过实验证明不同浓度的钩藤碱从细胞基底侧( BL) 到细胞刷状缘侧( AP) 的Papp与AP 到BL 侧的Papp比值均在1. 5 以上,说明药物以主动转运为主,且当加入P-gp抑制剂后,药物由BL 至AP 的转运量减少,反向的转运量却增加,以此证明钩藤碱在Caco-2 细胞上的转运由P-gp 介导?Hubatsch 等[11]利用Caco-2 细胞研究药物的吸收及渗透性,结果发现只要提前3 周在可渗透性支持物上培养Caco-2 单层细胞并进行分化,就可以在1 个工作日内完成药物渗透性的测定?

2. 3. 2 犬肾细胞( MDCK) 模型MDCK

张悦等[14]应用MDCK 细胞模型分别研究了2,6-吡啶二羧酸钒( Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ) 配合物的吸收能力和细胞毒性,并与Caco-2 细胞进行了比较?实验结果表明在预测完全靠简单扩散机制跨膜的点电荷小分子( 如金属配合物) 体内吸收能力上,MDCK 模型相较于Caco-2 细胞模型显得更为合理?樊慧荣等[15]在研究抗乙肝药物Y101 的体外运转机制时运用了MDCK-MDR1 细胞模型,采用液质联用的方法测定药物浓度,计算药物透过单层细胞能力的表观渗透系数以及反映药物外排能力大小的纯外排率,最终得出Y101 在肠吸收中存在外排机制?

2. 4 平行人工膜( PAMPA) 渗透模型

PAMPA 是以人工磷脂作为生物膜来模拟药物跨膜的屏障,用于测定药物的被动跨膜渗透[1]?在多孔的聚偏氟乙烯或聚碳酸酯膜上敷涂卵磷脂溶液,然后在孔隙处形成黑脂膜,利用这种黑脂膜模拟小肠上皮,测定通过被动扩散进入血液循环的药物的生物膜渗透性[16]?PAMPA 通透性测定法是一种可用于测定药物通过( 或保留) 浓缩的带负电荷的磷脂双分子层屏障通透性的方法?它能快速提供药物关于被动转运的信息( 仅限于被动转运,不包括旁细胞转运?主动运输?代谢等) ,是一个优异的细胞模型替代物,可用于药物的早期筛选[17]?

Avdeef 等[18]使用PKfluxa方法分析阳离子药物在Caco-2 细胞单层的pH 依赖性渗透性,并将结果与PAMPA 中获得的结果进行关联,随后用算法构建程序,在PAMPA 渗透率的基础上建立Caco-2 细胞渗透率的预测模型?最终发现Caco-2 细胞中得出的渗透系数与PAMPA 模型中获得的数据关联性很好,以此得出PAMPA 在一定程度上可以预测Caco-2细胞中的跨膜渗透率?王琳等[19]在研究左炔诺孕酮的有效渗透性时,在PAMPA 实验原理的基础上测定了药物在被动转运中的有效渗透性?最终测得的结果接近人体小肠灌流实验测得的结果,以此证明可将PAMPA 应用于药物的渗透性研究?

2. 4. 1 PAMPA 模型的特点

PAMPA 模型的优点在于高通量?低成本?PAMPA 与动物肠灌流方法相比,省去了动物饲养的过程,缩短了实验时间,提高了实验效率; 与Caco-2 细胞模型相比,省去了细胞培养的过程,并可以接受更广的pH 范围以至于可以更好地模拟生理环境,并且相较于Caco-2 细胞模型,PAMPA 可以接受更高的二甲基亚砜含量,使样品的溶解度更好,更有利于后期的分析工作[20]?缺点在于其仅用于研究通过被动转运跨膜的药物,主动转运的药物对于PAMPA 并不适宜?但是由于95%的药物都是经被动跨膜转运,PAMPA 仍可以被广泛应用?

2. 4. 2 PAMPA 模型在仿制药研究中的应用

我国仿制药在药品市场中的占比很大,并且很多早期批准上市的仿制药在有效性和安全性上都存在极大的不足,所以近年来国家大力发展仿制药质量一致性评价?由于需要进行一致性评价的药物数量庞大,我国随后颁布了《人体生物等效性试验豁免指导原则》,适用于仿制药质量和疗效一致性评价中普通口服常释制剂申请BE 豁免?其中根据要求,企业在申请BE 豁免时,需要提供有效数据证明申请药物属于BCS Ⅰ或Ⅲ类,即需证明药物具有高渗透性?上文提及的模型均可以在一致性评价中作为测定药物渗透性的模型,以下着重讲述PAMPA 渗透模型在仿制药一致性评价中的应用及实例?

药物BCS 分类的确定: 《ICH 协调指导原则-基于生物药剂学分类系统的生物等效性豁免( M9) 》中规定,符合条件的药物在申请豁免或简化BE 时,要提供生物药剂学分类相关信息以及高溶解性和高渗透性的相关数据,BCS 能通过测定药物的溶解度及渗透性预测药物体内的药动学情况,能在一定程度上预测体内药物代谢情况,给药物提供准确的BCS 分类,为药物的BE 豁免申请减少了时间?美国FDA 表示,该豁免原则基于3 层原理: ① 药物需要具备高溶解性以确保其不被限制吸收?② 同时需具备高渗透性确保药物在通过小肠的有限时间内被完全吸收?③ 快速溶解确保胃排空过程是高溶解度和高渗透性药物吸收的限速步骤[21]?

王洋洋等[20]在PAMPA 渗透分析法的基础上对药物溶出/吸收仿生系统( DDASS) 的生物膜系统进行改进,对一些工具药物进行渗透性考察,最终发现优化过的PAMPA 法对渗透性不同的药物考察结果与大鼠肠灌流得出的结果一致,并符合美国FDA 的药物BCS 分类,此研究结果表明将PAMPA 运用于药物渗透性研究中的可行性,并说明其有一定的参考价值?吴兆伟等[22]采用μDiAs TM 和μFlux TM 技术测定尼可地尔原料药的溶解度?固有溶出速率?有效渗透性和LogD 值,并结合溶解度和油水分配系数( LogD,LogP) 测定结果,从而确定了该药物的BCS分类?付晖等[23]采用μFlux TM 和MacroFlux TM 药物渗透性测定仪,测定了双氯芬酸钠的有效渗透性并对其进行BCS 分类,说明PAMPA 对于药物渗透性的研究结果可以运用到药物的BCS 分类测定中?

仿制药一致性评价: 口服固体制剂和注射制剂是当前一致性评价受理的仿制药品种的主要剂型?溶出度往往被作为评价口服固体制剂与参比制剂的质量是否一致的主要指标,但是在现实研究中,研究者发现有些品种存在溶出度很低?参比制剂和供试制剂批间溶出行为差异较大?溶出过快等情况,这说明了仅仅将溶出度设定为BE 的判定指标是不准确的?我国的仿制药质量与疗效一致性评价工作中要求仿制制剂与参比制剂在人体内具有BE,而BE 试验成本高?耗时长?失败风险较大,因此《人体生物等效性试验豁免指导原则》中规定,药物在申请豁免或简化BE 时,要提供生物药剂学分类信息以及高溶解性和高渗透性的支持数据,但并未规定使用什么方法进行测定?其中上文提到的对于药物的渗透性研究中,测定方法包括体内药动学方法或体外渗透性方法?

郭志渊等[25]利用DDDplus TM 软件评估富马酸比索洛尔片中主成分( API) 及辅料的物理参数对其溶出的影响,评估辅料对药物渗透速率的影响,并对其BE 进行预测?最终得出结论计算机模拟技术和PAMPA 渗透模型的结果能为富马酸比索洛尔片的BE 豁免提供数据支撑?尹婕等[26]运用PAMPA 渗透模型和Caco-2 细胞模型考察了佐匹克隆的有效渗透性,为佐匹克隆片剂的一致性评价提供了有效数据?王琳等[27]采用Macro Flux 型药物溶出度与渗透速率测试系统,以饱腹小肠模拟液( pH 5. 0) 为介质,通过PAMPA 对供试制剂和参比制剂的溶出和渗透行为进行了比较,并通过关键质量参数考察药物的释放与吸收过程,预测受试制剂的生物利用度,进而预测供试制剂与参比制剂之间是否符合一致性评价要求?

综上所述,PAMPA 技术对于药物的渗透性研究已被证实具有很高的数据可靠性,且可在一些药物的BCS 分类研究中广泛应用?PAMPA 在仿制药一致性评价中也可以得到很多的运用,有效地确定药物的BCS 分类可为其一致性评价提供数据支持,灵活地运用PAMPA 可以有效缩短一致性评价时间和减少资金消耗?

2. 4. 3 PAMPA 模型在其他方面的应用

PAMPA模型还可应用于以下研究方向?处方筛选: 同一种药物往往会存在很多不同的剂型?规格等,剂型不同会一定程度上影响制剂的效果,如缓控释片剂是通过运用与普通片剂不同的辅料达到缓释控释的目的?处方中的辅料会对药物在体内的吸收产生一定影响,在药物制剂的研发过程中我们可以通过体外评价的方法比较不同辅料的不同配比对药物API 溶解渗透的影响,从而间接预测药物在体内的吸收情况,以进行对于处方的筛选?运用PAMPA 评价药物辅料对于药物溶解渗透的影响,有利于避免处方中辅料对于药物在体内吸收的不良影响,从而有效地筛选处方?此法还可以比较处方不同的制剂之间的体外渗透情况,通过渗透数据分析结果预测药物的体内BE,因此在仿制药的研发中此法也被广泛应用?Borbas 等[28]采用PAMPA对替米沙坦参比制剂和市场上在售的仿制制剂进行处方对比,发现处方中辅料的不同对药物溶出度没有太大影响,但是却对药物的渗透性有很大影响?因此在制剂研发或仿制药研发的过程中我们也需要关注不同辅料对于药物渗透率的影响,PAMPA 就可以作为一个简单高效的筛选辅料的工具?

透皮给药制剂: 在透皮给药制剂的研究中,药物的皮肤透过性是透皮制剂的重点考察对象,透皮给药体外模型一般是扩散池法,即将人体皮肤或动物皮肤放入扩散池装置中,不少学者也已经在尝试用PAMPA 模拟皮肤屏障的功能,从而更加简洁高效地测定透皮制剂的药效[29 – 30]?

血脑屏障: 血脑屏障是一种保护大脑免受血液循环中有害物质的影响并调节特定分子从血液进入中枢神经系统的生物膜?很多中枢神经类药物的研究因为其不能通过血脑屏障而搁浅,PAMPA 可以作为检测药物血脑屏障渗透率的早期筛选模型?

Tsinman 等[31]通过大量的实验证明PAMPA 可以用于预测药物的血脑屏障渗透性,并有望凭借其低成本?高通量及快速的特性成为被动扩散通过血脑屏障的首选筛选模型?

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总结及展望

口服药物的吸收及其渗透性在药物的研发以及生产过程中都非常重要，但药物在人体的吸收代谢过程十分复杂，人体试验过程漫长，花费巨大且涉及伦理道德问题。人体BE 豁免的相关规定中要求申请人提供药物渗透性的相关信息，在开展仿制药一致性评价以来，近千个仿制药品种需要进行一致性评价的研究，故我们需要摸索准确简便的体外渗透模型预测药物在人体内的吸收程度。上述提到的口服药物渗透性评价方法各有优缺点及适应性，见表1，我们需要在对药物性质进行充分了解后选取最合适的评价方法。

未来我们可以通过现有模型建立药物渗透性研究的模型体系，以便于快速高效地确定药物的渗透特性，并收集整理数据，将药物的自身理化性质［如溶解度、酸碱性、药物的解离常数( pKa) 等］及其他特性( 如药物结构、作用靶点等) 一起整理成数据库，以便预测未知药物的渗透性。例如，有一未知其渗透性的药物，但是我们了解其理化性质及药物结构，就可以从数据库中选择与其性质最接近的药物进行比对，预测其渗透性属性，进而选择最合适的渗透模型对其渗透性进行测定。数据库建立后可以为仿制药一致性评价以及新药开发等工作服务，对于药品质量研究与控制以及药物研发都有比较重大的意义。

参考文献

详见 《中国新药杂志》 2022 年第31 卷第11 期

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