基于近、中红外光谱的热毒宁注射液制剂过程投料和二次热处理工序快速检测方法研究

热毒宁注射液（Reduning Injection，RI）是江苏康缘药业股份有限公司的独家品种，由青蒿Artemisiae Annuae Herba、金银花Lonicerae JaponicaeFlos、栀子Gardeniae Fructus 3味药材制得，具有清热、疏风、解毒的功效，常用于上呼吸道感染所致的高热、微恶风寒、头身痛、咳嗽、痰黄等症状及抑制流感病毒[1-2]。在中华人民共和国国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第九版）》中，针对重型、危重型新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）患者推荐的中成药中，RI也名列其中[3]。

RI的生产过程可以分为提取、精制和制剂过程，目前，利用近红外光谱（near-infrared reflectance spectroscopy，NIRS）或中红外光谱（mid-infrared reflectance spectroscopy，MIRS）技术结合化学计量学，针对RI提取、精制过程的快速检测已较为成熟，并取得一定的应用效果[4-8]。但是，基于NIRS和MIRS的RI制剂过程的快速检测研究尚未见 道。因此，基于RI的制剂过程，研究合适的快速检测方法，可为RI制剂过程的质量控制水平的提升提供技术支撑。NIRS以及MIRS作为过程分析技术的典型代表，近年来发展迅速。与传统的化学分析方法相比，这2种光谱分析方法具有以下优点：（1）可同时用于定性和定量分析；（2）分析速度快，只需扫描得出光谱即可测定样品中的各种成分；（3）不使用化学试剂，不损害样品，对环境友好；（4）分析成本低，操作简单[9-11]。

投料和二次热处理工序指的是投料和二次热处理2个连续工序，即在一定的温湿度以及压力下，依次将栀子提取物以及青金提取物投入到合并一定比例的注射用水和盐酸的配液罐中，待冷却后转移至冷藏罐；冷藏罐内药液通过板框过滤器滤过至热配间热配罐中，调节蒸气压力以及药液温度，一段时间后对药液进行冷却。

投料和二次热处理工序作为RI制剂过程的初始工序，在实际生产中，会出现提取物溶解不充分等情况，导致有效成分的损失，直接影响最后的成品质量，因此，亟需引入1种快速检测方法，降低生产过程控制风险。本实验将NIRS和MIRS技术与化学计量学结合，首次应用于RI制剂过程，建立投料和二次热处理工序6种关键质控指标的偏最小二乘（partial least squares，PLS）定量校正模型，实现对绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、栀子苷、断氧化马钱子苷及固含量的快速测定。

1材料与仪器

1.1材料

59批次的投料工序样本（批 Z220123～Z2201240、Z220201～Z220232、Z220301～Z220309）及对应批次的59批次的二次热处理工序样本，共118批次样品，由江苏康缘药业股份有限公司水针车间提供。对照品绿原酸（批 110753-202018，质量分数96.1%）、栀子苷（批 110749-201919，质量分数97.1%）购自中国食品药品检定研究院；对照品新绿原酸（批 DSTDX001503，质量分数99.58%）、断氧化马钱子苷（批 DST211224-111，质量分数98.87%）购自成都乐美天医药–德思特生物技术有限公司；隐绿原酸对照品（批 ST07850120，质量分数98.04%）购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。

1.2仪器

UltiMate 3000型高效液相色谱仪、Antaris II型傅立叶变换NIRS仪，配有透射检测器、采样软件以及Result、CAMO等数据处理软件，（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；React IR 702L型MIRS仪、XP6型电子天平，梅特勒–托利多仪器（上海）有限公司；BSA 224S-CW型万分之一电子天平，德国Sartorius公司；KQ-500DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q Academic型纯水机，美国Millipore公司。

1.3数据处理软件

采用Unscramble X 10.4（挪威Camo Analytics公司）软件进行光谱预处理；采用GraphPad Prism 8.0（美国GraphPad Software）绘图；采用Matlab R2018a（美国MathWorks公司）软件进行样本划分、波段筛选及模型构建。

2方法与结果

2.1NIRS的采集

以空气为扫描背景，采用NIRS技术于室温下采集光谱，选择1 mm比色皿，光谱扫描范围4000～10 000 cm?1，扫描次数为64次，分辨率4 cm?1，衰 减器选择B模块，1倍增益，每个样品采集3次，取平均光谱，得到59批投料工序样本及59批二次热 处理工序样本，共计118个样本。NIRS结果见图1。

2.2MIRS的采集

在室温条件下，使用光纤探头扫描样品，以空气为扫描背景；光谱扫描范围3000～650 cm ?1；扫描次数32次；分辨率8 cm ?1；增益选择“low”，每个样品扫描2次，取其一作为样本光谱，得到59批投料工序样本及59批二次热处理工序样本，共计118个样本。MIRS结果见图2。

2.35种质控指标含量的测定

2.3.1HPLC分析色谱条件参照崔小弟等[12]的实验结果，色谱条件设为Kromasil C 18（150 mm×4.6 mm，6 μm）色谱柱；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～5 min，15%～18%乙腈；5～15 min，18%乙腈；15～38 min，18%～31%乙腈；38～38.5 min，31%～90%乙腈；38.5～40 min，90%乙腈；体积流量0.7 mL/min；进样量10 μL；柱温20 ℃；检测波长238、327 nm。

2.3.2供试品溶液的制备精密吸取1 mL样品置于20 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3.3样品测定取118批次样品，按照“2.3.2”项方法制备供试品溶液，按照“2.3.1”项色谱条件进样测定，每份样品平行2次测定，取平均值，作为建模的质控指标含量实测值。6种质控指标的含量测定结果见表1。

2.4固含量的测定

参照文献方法[13-14]，称取约5 g样品至已烘干至恒定质量的称量瓶（X0）中，称定质量（X1），置烘箱105 ℃条件下烘干5 h至恒定质量，计为X2。

固含量＝( X 2－X0)/( X 1－X0)

2.5校正集与验证集的划分

采用Kennard-Stone（K-S）划分法[15]，将收集的59批投料工序样品以及对应批次的59批二次热处理工序样品，共计118批样品，以4∶1的比例划分为校正集和验证集，最终得到校正集样本94个，验证集样本24个。

2.6光谱预处理

采集光谱时，由于受到环境温度、湿度、仪器状态、杂散光和随机噪声等因素的影响，红外光谱会出现基线漂移和噪声干扰等问题，因此，在建模前对光谱进行适当的预处理是有必要的，可以有效地减少噪声，净化无用信息，提高模型的精度和预测效果。常见的预处理方式有：移动平均法（moving average，MA）、Savitzky-Golay（S-G）平滑法、导数法（一阶导数、二阶导数）、矢量归一化法、基线 校正、标准正态变换（standard normal transformation，SNV）、多元散射校正（multivariate scattering correction，MSC）以及上述方法的结合。MA和S-G平滑法可以消除光谱信息中的随机噪声，提高信噪比；一阶导数可以消除背景的常数平移，二阶导数可以消除背景的线性平移，消除背景漂移造成的影响；矢量归一化法通过增强光谱数据间的差异，校正由光程变化或者样品浓度改变引起的光谱变化；基线校正可以消除仪器背景漂移对信 的影响；SNV和MSC可以消除由于样品分布不均匀对光谱造成的影响[16]。

本研究采用MA、S-G平滑、S-G 1 st、基线校正、归一化法以及SNV分别对NIRS和MIRS进行预处理，并分别建立投料和二次热处理工序的6种质控指标的PLS定量校正模型。根据模型评价指标筛选出最佳的光谱预处理方法，使用留一交叉验证法确定校正模型中的最佳的潜变量数（latent variables，LVs），以预测相对误差（relative standard error of prediction，RSEP）为主要评价指标，RSEP值越小越好。一般而言，性能优异的预测模型应具有较高的校正集相关系数（rcal）及验证集相关系数（rpre）、较小且接近的校正均方根误差（root mean square error of calibration，RMSEC）和交叉验证均方根误差（root mean square error of cross validation，RMSECV）及较低的RSEP [17]。上述评价指标的相关公式为式（1）～（4）。

rcal＝[1－∑( y －y i ) 2 / ∑( y －y m ) 2 ] 1/2 （1）

rpre＝[1－∑( y －y i ) 2 / ∑( y －y n ) 2 ] 1/2 （2）

RMSEC＝[∑( y －y i ) 2 / m] 1/2 （3）

RSEP＝[∑( y －y i ) 2 / ∑ y 2 ] 1/2 （4）

m、n为校正集、验证集样本数，y为实测值，y i 为预测值，y m 、y n 分别为校正集和验证集实测值的平均值

NIRS和MIRS预处理结果见表2、3，可以发现：基于NIRS，当绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、栀子苷、断氧化马钱子苷及固含量分别以SNV、MA、MA、无预处理、SNV和归一化法为预处理方法时，RSEP最小，且都在4.0%以下，此时，rcal与rpre值较大，RMSEC与RMSECV值较小且接近；基于MIRS，当绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、栀子苷、断氧化马钱子苷及固含量的预处理方法分别为无预处理、MA、MA、MA、SNV和无预处理时，模型具有较低的RSEP，均小于5%，较大的rcal与rpre值以及较小且接近的RMSEC与RMSECV值，从预处理方法的比较中可以猜测，在MIRS中，MA适合多数质控指标，可能是由于其减轻了光谱信息自身携带的随机误差，提高信噪比。

2.7光谱波段的筛选

全光谱模型的准确性和稳健性可能会因为一些无关信息的存在而减弱，筛选光谱波段可以剔除无用信息，提高模型的预测精度和稳定性。本研究在上述筛选出的最佳预处理方法的基础上，对比全光谱、间隔PLS（interval PLS，iPLS）、组合间隔PLS（synergy interval PLS，siPLS）及移动窗口PLS（moving windows PLS，mwPLS）建模的效果。

2.7.1iPLS筛选最优波段iPLS 是由N?rgaard等[18]提出的一种光谱区间筛选方法，通过将全光谱平均分为若干子区间，在各子区间内以不同的潜变量数建立独立的PLS回归模型[19]。本研究将光谱区间均分为20个子区间，并以RMSECV作为评价指标，筛选出最优建模波段。

2.7.2siPLS 筛选最优波段siPLS 是在iPLS的基础上，对不同子区间进行任意组合，建立所有可能的2、3或4个区间的PLS回归模型[20]。本研究将光谱区间均分为20个子区间，以子区间组合数为3建立模型，以RMSECV作为评价指标，筛选出最优建模波段。

2.7.3mwPLS 筛选最优波段mwPLS 的基本思想是将1个窗口沿着光谱轴连续移动，每移动1个波长点，采用交叉验证法确定最佳潜变量数并建立相应的PLS最优模型[21]。本研究以全光谱波数的10%作为窗口宽度，以RMSECV作为评价指标，筛选出最优建模波段。

2.7.4最优波段筛选结果由3种波段筛选方法建立的模型与全光谱模型的性能参数对比结果见表4，以RMSEC、RMSECV和RSEP作为评价指标，综合评价，筛选出最优建模波段。结果表明，基于NIRS，绿原酸和断氧化马钱子苷的预测模型经3种 方法筛选波段后，虽然建模变量数减少，但RMSEC、RMSECV普遍增大，且RSEP均增大，模型预测性能下降，故选择全光谱区间（3 999.64～9 999.10 cm?1）建模；新绿原酸、隐绿原酸及栀子苷预测模型，采用siPLS筛选波段后，建模变量数降为465个，rcal、rpre均增大，RMSEC、RMSECV均减小，且RSEP均减小，模型预测性能提升，故新绿原酸、隐绿原酸及栀子苷分别选择4 601.32～4 900.23、5 503.84～5 802.76、7 609.73～7 906.71 cm?1，5 503.84 ～5 802.76、5 804.69～6 103.60、7 308.89～7 607.80 cm?1及4 300.48～4 599.39、5 203.00～5 501.92、5 804.69～6 103.60 cm?1作为最优建模波段；固含量预测模型采用siPLS筛选波段后，虽然rcal、rpre略微减小，RSEP略微增大，但是RMSEC、RMSECV减小且接近，故固含量选择4 300.48～4 599.39、5 503.84～5 802.76、7 008.05～7 306.96 cm?1作为最优建模波段。

基于MIRS，隐绿原酸预测模型经3种方法筛选波段后，虽然建模变量数减少，但rcal、rpre减小，RMSEC、RMSECV普遍增大，且RSEP增大，模型预测性能下降，故选择全光谱区间（3 000.00～648.00 cm?1）建模；绿原酸、栀子苷、断氧化马钱子苷和固含量的预测模型经采用siPLS筛选最优波段后，建模变量数降为87个，rcal、rpre普遍增大，RMSEC、RMSECV较小且接近，RSEP均增大，模型预测性能提升，故绿原酸、栀子苷、断氧化马钱子苷和固含量分别选择1 572.00～1 460.00、1 224.00 ～1 112.00、1 108.00～996.00 cm?1，1 572.00 ～1 460.00、1 340.00～1 228.00、1 108.00～996.00 cm?1，1 688.00～1 576.00、1 224.00～1 112.00 、1 108.00～996.00 cm?1及1 456.00～1 344.00 、1 224.00～1 112.00、1 108.00～996.00 cm?1作为最优建模波段；新绿原酸预测模型采用mwPLS筛选最优波段后，建模变量数降为59个，RMSEC、RMSECV较小且接近，且RSEP略微减小，模型预测性能提升，故新绿原酸选择1 401.00～1 172.00 cm?1作为最优建模波段。

2.8PLS模型的建立

模型经过光谱预处理方法的选择、最佳的潜变量数的确定及最优建模波段的确定后，运用PLS分别建立了6个质控指标的NIRS和MIRS最佳定量校正模型，6个质控指标的NIRS模型预测效果均强于MIRS模型，故选择6个质控指标的NIRS预测模型作为最优模型，结果见表5。图3为对应的6种质控指标的最佳模型的预测值与实测值的相关性。从表5可见，对于RI制剂过程的投料和二次热处理工序的6种质控指标绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、栀子苷、断氧化马钱子苷及固含量，利用NIRS建模，其RSEP分别为1.473 4%、3.431 8%、2.589 5%、1.070 6%、2.294 6%、1.329 8%，均小于4%。而利 用MIRS建模，其RSEP分别为2.093 7%、4.317 9%、4.172 6%、2.320 5%、3.816 4%、1.720 3%，均小于5%。鉴于NIRS及MIRS模型的RMSEC及RMSECV也均令人满意，可以认为NIRS及MIRS模型均满足实际运用的需要，可以快速有效地预测投料和二次热处理工序的6种质控指标的含量预测。

将验证集的光谱数据导入用已建立的最佳模型中，即NIRS预测模型。根据样品的实测值和模型 预测值，计算其相对误差。绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、栀子苷、断氧化马钱子苷和固含量的模型预测值与样本实测值的平均绝对偏差（ mean absolute，MAD）及平均相对偏差（mean relative bais，MRB）见表6，结果显示这6种质控指标的MRB均小于3.00%。

MAD＝( y －y i )/ n （5）

MRB＝MAD/ （6）

n为验证集样本数，y为实测值，y i 为预测值，为样本实测值的平均值

3 讨论

本研究首次以RI制剂过程为研究对象，采用NIRS和MIRS技术，结合PLS法，经过光谱预处理方法及建模波段筛选，建立了投料和二次热处理工序的绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、栀子苷、断氧化马钱子苷和固含量的定量预测模型。对比NIRS和MIRS模型对6种质控指标的预测效果，可以发现，NIRS模型均优于MIRS模型，这可能与质控指标的质量浓度有关系。5种质控指标成分的平均质量浓度分别为9.851 8、2.478 3、2.740 8、13.633 5、1.302 3 mg/mL，均高于1 mg/mL，可以认为均为高质量浓度分析物，平均固含量7.995 1%亦属于高质量分数。这与Tao等[22]的研究结果相符合，即对于高质量浓度的分析物，NIRS表现出比MIRS更好的预测性能。

根据平均质量浓度对6种质控指标进一步分组，将新绿原酸、隐绿原酸及断氧化马钱子苷分为高质量浓度组，绿原酸、栀子苷及固含量分为超高质量浓度组，以预测模型的RSEP作为决定评价指标，可以发现，超高质量浓度组预测模型的RSEP均小于较高质量浓度组，可以猜测，NIRS模型对高质量浓度样品具有优异的预测效果，并且质量浓度越高，预测效果越好，后续可以通过增大样本量来验证。NIRS模型与MIRS模型预测效果存在差异，也有可能是由于NIRS相较于MIRS，其波数更多，建模变量数更多，数据中包含的信息更加丰富，使得其最终模型预测效果更佳，这也需要后续的研究证明。

本研究表明，NIRS与MIRS模型都适用于这6种质控指标的预测，2种光谱技术在离线或者在线检测方面各有所长，NIRS模型预测精度高、检测速度快、稳定性好[23]；MIRS建模参数少、仪器小巧便携，而且可以适用于混悬体系样品的检测，减少了样品的预处理过程，扩大了红外光谱的应用范围[24]，但同时MIRS对环境的要求更高，仪器位置的改变、温湿度及压力的变化、光纤的弯折程度等都会对光谱产生影响。与传统化学分析方法相比，这2种光谱分析技术更环保，耗时更少，均可以对RI投料和二次热处理工序的质控指标进行快速检测，也为后续的RI制剂过程的全工序快速检测研究奠定了基础。

参考文献（略）

来 源：童 枫，徐芳芳，张 欣，李执栋，吴 云，章晨峰，王振中．基于近、中红外光谱的热毒宁注射液制剂过程投料和二次热处理工序快速检测方法研究 [J]. 中草药, 2022, 53(21): 6706-6715 .