MPB：中科院城环所苏建强、朱永官等-功能基因高通量定量方法

图1 高通量定量PCR技术流程^[4]

2.各试剂在微孔芯片运行的反应体系参考表1（SYBR Green染料法）和表2（Taqman探针法）。

表1. SYBR Green染料法荧光定量的体系（100 nl）

表2. Taqman探针法荧光定量的体系（100 nl）

3.根据以上终浓度分别配制sample plate mix和assay plate mix。以72 assays×72 samples的阵列为例：

3.1配制sample PCR reagent Mix（一个chip的量）。如表3：

表3 Sample PCR reagent Mix的配制

1）将配置好的 PCR regent mix 混合均匀，转移进加样槽中，按照72 assays×72 samples的阵列样品分布格局（如图1）避光条件下在384-well sample sourceplate上分配体积，每个孔中加样体积如下：

Prepared mix   12.4 ul

DNA样品      3.1 ul

注：排枪使用“倒吸法”防止气泡产生，同时避光操作

3.2配制assay PCR reagent Mix（一个chip的量）。如表4（SYBR Green染料法）和表5（Taqman探针法）：

表4 SYBR Green染料法assay PCR reagent Mix的配制

表5 Taqman探针法assay PCR reagent Mix的配制

1） 将配置好的PCR regent mix混合均匀，转移到加样槽中，按照72 assays×72 samples的阵列样品分布格局（如图1）避光条件下在384-well assay sourceplate上分配体积，每个孔中加样体积如下：

Prepared mix   12.4 ul

引物探针        3.1 ul

注：排枪使用“倒吸法”防止气泡产生，同时避光操作

3.3将分装好试剂的assay sourceplate和sample sourceplate的无菌384板上贴上封板膜，采用刮板将封板膜紧密贴在384板上，将384板于冷冻离心机4°，3500 x g离心5 min。随后将384板置于4 ℃冰箱避光保存备用。

注：切勿反转384板以免液体黏在封板膜上

3.4高通量定量仪器运行操作

1）运行SmartChip Multisample Nanodispenser仪器

注：该仪器主要用于将384板上的mixture分装到芯片上

a.打开SmartChip Multisample Nanodispenser仪器开关；

b.检查气瓶气体含量（确保气体含量>0.3 mpa），检查曝气瓶，确保曝气水瓶装满超纯水；

c.检查NaClO溶液瓶，每周更换一次NaClO溶液（NaClO有效氯终浓度0.2%，主要用于清洗管道除菌）；

d.打开气瓶气阀与曝气水瓶气阀，曝气30min，压力控制40 psi；

注：曝气务必充分，否则导致芯片表面有水珠出现

e.曝气完毕，关闭曝气水瓶上的气阀，在电脑操作界面进行daily warm up三次和tip clean一次；

f.设置参数—setup-mode-gene expression + Chip number –assays（72），samples（72）；

g.输入引物板排列文件和样品板排列文件，输出layout—Chip number的layout文件；

h.分装assay sourceplate即引物板，将384板放置仪器样品分装室内侧（注：确保384板紧扣位置，且分装样品靠近最内侧）。放置芯片，记录芯片编 ，并将标有编 的一端靠近分装室最外侧。点击“dispense assays”—“yes”，运行完毕点击“tip clean”3次。

i.取下芯片，采用滤纸覆盖轻压表面，检查是否有水珠出现，小心在表面粘贴白膜，冷冻离心机4°，3500×g离心5 min。

j.取下assay sourceplate，同样的方式置换sample sourceplate，重新放置已分装引物的芯片（注：必须与前一步放置方向相同），点击“dispense assays”—“yes”，运行完毕点击“tip clean”3次。

注：每次芯片分装完样品注意一定要进行tip clean，分装完所有样品后务必进行daily clean。

k.取下芯片，采用滤纸覆盖轻压表面，检查是否有水珠出现，小心在表面粘贴蓝膜（注意贴膜方向），冷冻离心机4°，3500×g离心10 min。

2）运行SmartChip Cycler仪器

注：该仪器主要用于运行荧光定量PCR程序，收集荧光信 。

a.首先打开SmartChip Cycler仪器，随后再打开电脑电源；

b.检查气瓶压强，确保气瓶总压力不低于100psi，否则及时更换气瓶，仪器运行时压力维持在120 psi；

注：此步较为重要，影响后续荧光信 的收集。

c.设置需要的protocol，导入Multisample Nanodispenser仪器仪器上生成的layout文件，选择project；

d.放置芯片，使蓝膜周边与仪器紧密粘贴，设置芯片信息，点击“run”，运行仪器；

注：确保芯片放置方向正确。

e.选择结果文件存放位置，检查pressure是否处于“OK”状态，检查是否出峰。

f.运行结束后导出数据，点击“analysis”，随后选择“file”下拉“save cell data as”保存为txt格式文档。

3.5数据处理—计算功能基因拷贝数

1）使用Canco软件获得各基因在各样本中的检出情况和Ct值（扩增循环数），同时构建分别含有待检测的功能基因的标准质粒，根据已知浓度的标准质粒的Ct值绘制标准曲线y=kx+b；

2）根据SmartChip Real-Time PCR System和Canco软件给出的各基因在各样本中的Ct值整理成Ct值总表并进行质控，质控条件如下：

a.当扩增效率小于1.8或大于2.2将舍弃该基因；

b.当阴性对照有扩增，则舍弃该基因；

c.当Ct值大于31时将认为没有扩增，舍弃该基因在对应样本中的Ct值。

注：其中在表格中标注“0”代表该基因在对应样本中未检出。而只有在三个技术重复中均被检出的基因，才会将该基因判定为阳性，并计算其平均值作为该基因在对应样本中Ct值。Ct值代表该基因在对应样本中的扩增循环数，Ct值越小意味着该基因在对应样本中的起始含量越高。

3）将样本Ct值代入标准曲线公式，获得样本基因的绝对定量信息，统计各基因在各样本中的基因数目。相对丰度的计算采用公式：相对拷贝数 = 10^(31-Ct)/(10/3)进行计算。

溶液配方

1.无菌384板、无菌枪头及无菌离心管：采用高压蒸汽灭菌，灭菌条件为120°，30min，103.4kPa。

致谢

本工作的开展是在国家重点研发计划(2017YFE0107300)，国家自然科学基金(31722004,21936006)等项目的支持下完成的，感谢科技部与国家自然科学基金委的支持。

参考文献

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2.Zheng, B. X., Zhu, Y. G., Sardans, J.,  Pe?uelas, J. and Su, J. Q. (2018) QMEC: a tool for high-throughput quantitative assessment of microbial functional potential in C, N, P, and S biogeochemical cycling. Science China Life Sciences, 61: 1451–1462.

3.Zhu, Y. G., Johnson, T. A., Su J. Q., Qiao M., Guo G. X., Stedtfeld, R. D., Hashsham, S. A., Tiedje, J. M. (2013) Diverse and abundant antibiotic resistance genes in Chinese swine farms. Proc Natl Acad Sci U S A. 110(9): 3435-40.

4.An, X. L., Wang, J. Y., Pu, Q., Li, H., Pan, T., Li, H. Q., Pan, F. X., Su, J. Q. (2020) High-throughput diagnosis of human pathogens and fecal contamination in marine recreational water. Environ Res, 190:109982.

5.Zhuang, F. F., Li, H., Zhou, X. Y., Zhu, Y. G., Su, J. Q. (2013) Quantitative detection of fecal contamination with domestic poultry feces in environments in China. AMB Express 7(1): 80.

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