新疆医科大学第一附属医院口腔医院分享：骨疏康干预犬上颌第一磨牙压低模型的实验研究

文题

骨疏康干预Beagle犬正畸牙根吸收过程中的成骨分化及机制

? 实验动物

雄性Beagle犬16只，体质量(12±1) kg，恒牙列完整、形态正常，牙齿及牙周健康，无明显的错颌畸形，口腔环境及牙列形态基本相一致，由新疆医科大学动物实验中心提供，动物质量合格证编 ：1107292011000023。实验方案经新疆医科大学动物实验管理中心伦理委员会批准(伦理审批 ：IACUC202101113-01)。

? 主要药物及试剂

骨疏康(胶囊，溶于水后用于灌胃，辽宁康辰药业有限公司)；TIANScript RT Kit、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(天根，中国)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Solarbio，中国)；兔多抗RUNX2(abcam，美国)；兔多抗β-连环蛋白(Proteintech，中国)；HRP标记羊抗兔二抗(Bioswamp，中国)。

? 实验方法

1 实验动物分组

适应性喂养1个月后，将Beagle犬随机分为正常对照组(n=4)、蒸馏水组(n=6)与骨疏康组(n=6)。正常对照组不做任何处理，正常饲养；蒸馏水组建立双侧上颌第一磨牙压低动物模型(正畸矫治手术)，造模后灌胃给予蒸馏水100 mL/d；骨疏康干预组建立双侧上颌第一磨牙压低动物模型，造模后灌胃给予骨疏康2.1 g/(kg·d)，造模后每天早晨10点灌胃。造模后6，9，12周，蒸馏水组与骨疏康组分别选取2只犬，进行相关指标的检测。正常对照组直接取材。

2 犬上颌第一磨牙压低模型的建立

种植钉的植入：将比格犬称质量后，按照0.1 mL/kg肌注现配好的1∶1舒泰50与速眠新，5 min左右比格犬陷入深度睡眠，药效持续0.5-1 h。植入部位局部消毒后，在双侧上颌第一磨牙与第二磨牙颊侧和腭侧牙槽间隔附着龈与黏膜交界处，先用手术刀做切口，剥离牙龈黏骨膜，使用专用工具将微型种植体缓慢旋入适宜深度。若骨皮质坚硬，则先用先锋钻穿破骨皮质，再旋入微型种植体，在手术全过程中严格无菌操作。

矫治器的安置与施力：以橡皮链施力，使橡皮链跨越牙齿的牙合面，两端固定于颊腭侧的种植钉上，使用测力计测量加力力值100 g。术后加强对比格犬的护理，增加保温措施，进食高蛋白软食补充营养，自由饮水，术后连续3 d肌注青霉素钾8×104 U/kg，1次/d，口服甲硝唑片，2片/次，2次/d，预防感染发生。时刻关注比格犬身体情况及精神状态，检查微种植体是否脱落，链状橡皮筋是否在位及时做出调整，每4周更换一次链状橡皮筋,并使用正畸专用测力计施加力值。

3 一般情况观察

造模后6，9，12周， 观察Beagle犬压低磨牙的压低程度，并以照片形式观察压低效果。在规定时间内收集整个第一磨牙组织，并立即放入液氮中保存。设置骨疏康组第二磨牙为压低旁组织。

4 qRT-PCR检测

造模后6，9，12周，采用qRT-PCR检测磨牙组织中骨形成蛋白2、牙本质涎磷蛋白、RUNX2和骨钙蛋白的mRNA相对表达量。

通过DNAMAN软件设计骨形成蛋白2、牙本质涎磷蛋白、RUNX2和骨钙蛋白荧光实时定量PCR引物，并由上海生工有限公司合成。引物序列见表1。

反转录cDNA步骤：5×Hiscript Buffer 4 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 4 μL，Oligo(dT)18(10 μmol/L) 2 μL，Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，Hiscript Reverse Transcriptase 1 μL，RNA 5 μg，ddH2O加到20 μL，混匀后，25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min。qPCR反应：正反引物各0.4 μL，SYBR Select Master Mix 10 μL，ddH2O 4.8 μL，50×ROX Reference Dye 2 0.4 μL，cDNA 4 μL，配制成20 μL体系混合均匀，95 ℃ 10 min，95 ℃15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15s ，40个循环，获得qPCR反应结果，采用2-ΔΔCt方法用于结果量化计算。

5 Western blot检测

造模后6，9，12周，采用Western-Blot检测β-连环蛋白、RUNX2的蛋白表达。将磨牙组织裂解、离心、BCA定量后，配置5%浓缩胶和12%分离胶，进行样本变性加样、电泳和转膜，将膜装入5%TBST封闭液，制置室温摇床2 h，分别加5 mL兔多抗RUNX2、兔多抗β-连环蛋白稀释液(1∶1 000)，4 ℃过夜。加入1 mL HRP标记羊抗兔二抗(1∶10 000稀释)，置于摇床上2 h。显色，在暗室中压片曝光显影。结果用BandScan分析胶片灰度值，分别计算检测蛋白条带与参比蛋白条带强度比值(%)。

? 主要观察指标

各组磨牙组织RUNX2、牙本质涎磷蛋白、骨形成蛋白2、骨钙蛋白的mRNA表达，以及RUNX2和β-连环蛋白的蛋白表达。