基因检测为儿科肾结石和肾钙质沉着症提供精准医学方法：单中心队列

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Huang, L., Qi, C., Zhu, G. et al.Genetic testing enables a precision medicine approach for nephrolithiasis and nephrocalcinosis in pediatrics: a single-center cohort.Mol Genet Genomics297, 1049–1061 (2022). https://doi.org/10.1007/s00438-022-01897-z

基因检测为儿科肾结石和肾钙质沉着症提供精准医学方法：单中心队列

目的

遗传因素是小儿肾结石 （NL）/肾钙质沉着症 （NC） 的主要原因。我们总结了中心遗传性NL/NC的基因型-表型相关性，以评估基因检测在早期诊断中的作用。

方法

回顾性分析了2017年5月至2020年8月32例疑似有遗传基础的NL/NC病例的临床数据。以三全外显子组测序为主要方法进行基因检测，通过Sanger测序确认变异，并利用定制软件根据蛋白质功能预测致病性分析。

结果

在32例NL / NC患者中检测到24例致病性单基因突变，并在一例患者中检测到拷贝数变异。遗传性疾病患者的表现总结显示，在遗传性疾病中常见显著程度的生长迟缓、低分子量蛋白尿排泄增加、高钙尿症、电解质失衡和发病年龄小。此外，一些患者的肾功能异常（3 ppm 25）。最常见的病理是远端肾小管性酸中毒（包括SLC4A1、ATP6V1B1和ATP6VOA4基因），其次是牙本质病（CLCN5和OCRL1基因）、原发性高草酸尿症（PH）（AGXT和HOGA1基因）和歌舞伎综合征（KMT2D基因），它们更有可能表现为NC或复发性结石，并且与特定的生化表型和肾外具有更高的相关性。表现型。

结论

NL/NC 的病因是异质性的。本研究深入探讨了32例患者的表型与基因型之间的关系，证实了基因检测和临床表型评估使精准医学方法能够治疗患者。

介绍

涉及世界许多国家的流行病学数据显示，肾结石（NL）的发病率为1-19%，特别是在亚洲国家（Khan等人，2016）。最近的数据显示，儿童的发病率每年增加约10%（Hernandez等人，2015;劳斯等人，2010）。与尿道梗阻和复发性尿路感染（UTI）相关的年轻发病和疼痛复发性疾病被认为与急性肾损伤（AKI），慢性肾病（CKD）和矿物骨病（MBD）的风险较高有关（Bonzo和Tasian 2017;萨哈伊等人，2011年;唐和李斯克2014）。肾钙质沉着症（NC）被定义为草酸钙（CaOx）或磷酸钙（CaPi）在肾脏中的广泛沉积。由于NL和NC之间临床表现的相似性，后者经常被误诊，并且通常与肾功能丧失有关（Shavit等人，2015）。

NL / NC的病因是多因素的，与遗传学，全身性疾病（炎症性肠病，甲状旁腺功能障碍），代谢因素，肾脏结构异常和复发性尿路感染有关（Khan等人，2016）。它与成人常见的代谢因素（如糖尿病、高血压和肥胖）是有区别的。高钙尿症是在NL或NC儿童中检测到的最常见的代谢异常，对于复发性NL或进行性NC尤其重要（Gürg?ze和Sar? 2011;塞茨等人，2017;斯皮瓦考等人，2008）。

之前对268名NL / NC患者和134名儿科NL / NC患者的分析表明，30多个已知NL / NC基因之一的单基因致病突变可以在11.4%的成年个体中检测到，16.7-20.8%的个体<18岁（Amar et al. 2019;布劳恩等人，2016;达加等人，2018;Halbritter等人，2015），以及0.4%的早发性CKD诊断（维万特和希尔德布兰特2016）。许多遗传性疾病导致 NC，伴或不伴肾结石，包括牙本质病、Lowe 综合征、巴特综合征和远端肾小管性酸中毒 （dRTA），以及原发性高草酸尿症 （PH）患者。CKD 经常在复发性 NL 或进行性 NC 患者中观察到，这些患者具有较长的病史。为疑似患有遗传性NL / NC的患者寻找致病基因可以帮助我们做出精确的遗传诊断，并提供有针对性的药物干预。

材料和方法

队列

从2017年5月至2020年8月，我们中心共对32名来自无关的中国家庭且被诊断为遗传性NL / NC的患者进行了回顾性回顾。包括21名男性和11名女性，年龄从3个月至14岁不等（补充表1和2）。该研究方案由武汉市儿童医院（中国武汉）伦理委员会批准。我们获得了研究中包括的所有法定监护人的知情同意。所有患者均通过超声或计算机断层扫描（CT）诊断为NL或（和）NC（2例），并接受代谢评估，包括测量电解质水平（钙，镁，钾，钠，氯和磷），肌酐水平以评估肾功能，尿常规，尿钙/肌酐比值或24小时尿样和人口统计数据中的尿钙水平。必要时，测量甲状旁腺激素（PTH）和维生素D水平，并进行骨X线和结石分析。

基因测序

获得了患者及其父母的血液样本。以三全外显子组测序为主要基因检测，通过Sanger测序确认变异，利用定制软件预测蛋白质功能的致病性分析。两名患者因面部畸形和精神运动迟缓而接受拷贝数变异（CNV）分析。

将样品测序至至少2.5 GB，产生成对的250个核苷酸读数。根据制造商的方案（美国加利福尼亚州圣地亚哥市 Illumina），从血液淋巴细胞中分离出基因组 DNA，并使用 xGen 外显子组研究小组 v2.0 使用 IDT 进行外显子组捕获。合并的文库在光明 HiSeq 2000测序平台上进行测序。在我们的队列中，覆盖率至少达到50×，靶标测序覆盖率不低于99%。将序列读数映射到人类参考基因组组件（37/hg19
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome），通过搜索公开可用的种群数据库（1000个基因组计划
http://browser.1000genomes.org/，外显子组聚合联盟ExAC
http://exac.broadinstitute.org/）来评估变异的频率，并通过包括DECIPHER在内的数据库确定变异的致病性（
http://decipher.sanger.ac.uk/） 和克林瓦尔 （
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar）。变异按频率和变异类别进行过滤，并在人类在线孟德尔遗传（OMIM，https://omim.org/）中限制在1%或更低的次要等位基因频率（MAF）中。用软件SIFT（从耐受性中分选不耐受，http://sift.jcvi.org）和PolyPhen2（多态性表型v2，
http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2）预测蛋白质功能。应用美国医学遗传学和基因组学学会的变异分类指南（ACMG）对致病性进行分类，所有变异均通过Sanger测序得到证实。

我们对全基因组测序（WGS）数据进行了CNV分析。总测序深度约为0.2-0.6×，检测灵敏度为0.1 Mb大小的DNA扩增或缺失。我们使用DGA（基因组变异数据库，
http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home）进行变异的致病性。

突变分析由一组临床医生 – 科学家和遗传学家进行，他们在遗传性肾脏疾病和生物信息学家方面具有领域专业知识。致病性和可能的致病性变异被确定为致病性变异，不确定的致病性变异被鉴定为意义未知的变异（VUS）。

统计检验

年龄变量不符合使用K-S正态性检验的正态分布，并且在统计描述中用中位数和四分位数表示。卡方检验或费舍尔精确检验用于比较分析不同组之间NL或NC发生率的定性变量。在非正态分布的情况下，威尔科克森检验用于定量变量的比较。P值为<0.05表示统计显著性，基于与对照组相比的费希尔精确检验，并通过SPSS软件执行数据分析（IBM SPSS统计22）。

结果

队列特征和临床特征

我们中心共有32例被诊断为遗传性NL / NC的患者接受了基因检测并进行了代谢评估。包括21名男性和11名女性，年龄从3个月到14岁不等，其中15名患者年龄在2岁以下，中位数为2.54岁（0.88岁，4.81岁）。临床特征见附表1和2。SLC4A1和KMT2D是最常见的变异基因，在所有检测到的类型中，错义变异是最多的（图1A，图1B）。

有13例确诊为孤立性NC病例，19例为NL病例。其中，10块石头有多块石头，6块NL与NC合并，3块石头只有一块（图1C）。在我们的队列中，生长迟缓、低分子量蛋白 （LMWP） 尿排泄增加、高钙尿、电解质失衡和发病年龄小都很常见，特别是对于确诊为分子的患者。肉眼血尿，腹痛和复发性感染发生在有症状的患者中。然而，大多数患者是无症状的。导致诊断的临床表现包括骨质疏松、运动技能或智力迟钝以及厌食（图 1D）。

图 1

NL/ NC患者的分子诊断结果和临床特征。A 说明了测试结果的摘要。AD和AR是最常见的遗传模式，最常见的变异基因是SLC4A1和KMT2D。其中，SLC4A1具有AD和AR两种遗传模式，B共检测到35个变异突变，其中23个错义突变，4个无义突变，1个非移码突变，3个移帧突变，2个剪接突变和1个外显子丢失。C 临床表现摘要显示，13例为分离性NC，19例为NL，其中10例为多块结石，6例为NL合并NC，3例为单块结石。D 如果存在症状，肉眼血尿、腹痛和反复感染的可能性更大。然而，大多数患者是无症状的。导致诊断的临床表现包括骨质疏松、智力或运动迟缓以及厌食。E 最常见的两种疾病是dRTA和歌舞伎综合征，其次是Dent病和PH.F尿酸化失败和高钙尿症患者（1组）更容易显示NC（卡方试验P= 0.0009），高尿酸尿症，胱氨酸尿症和高甘油尿症患者（第2组）更容易发生NL（P= 0.0289）。其他基因（第3组）和基因阴性组（第4组）中NL的比例无统计学差异。（P= 0.6664，P= 0.4012）。NL 加 NC 标记为黄色;NC标记为蓝色;NL 标记为黄色

基因分析

通过全外显子组测序（WES）或WES加CNV，我们在78.1%的病例（25 ppm 32）中发现了遗传学诊断，其中24例检测到单基因疾病，1例检测到基因组片段缺失。基因型特征反映在补充表3中。大多数患者导致单基因遗传性肾小管病，有16种单基因。在32例患者中的19例中检测到已知NL / NC的致病突变或可能的致病突变，并检测到其他遗传异常的5个致病突变，并检测到一个具有拷贝数变异的突变。测试结果的摘要如图1A和表1所示。其中，1例为近亲，2例为母亲有产科异常史，3例为NL/NC家族史。在没有确诊致病性突变的患者中，有五名患者有结石家族史。

表1 我们中心32例NL和（或）NC患者的队列特征

我们注意到，<2岁的患者（25例中有13例，52%），经确诊的分子诊断显示为主要临床特征，生长迟缓（25例中有20例，80%），精神运动迟缓（25例中有9例，36%），高钙尿症（25例中有8例，32%），LMWP（25例中有13例，52%）和电解质紊乱（25例中有9例）， 36%）（附表1）。此外，三名患者（12%）肾功能异常，估计肾小球滤过率范围为60至90 ml /min/ 1.73 m2，相当于第二期慢性肾病。分子诊断阴性的患者比例为14.2%（7人中有1人）（补充表2，表1）。

在单基因疾病患者中，共检测到16个变异基因，包括23个错义突变，4个无义突变，1个非移码突变，3个移帧突变，2个剪接突变和1个外显子丢失（图1B）。33个突变中有23个（69.7%）是新的。遗传模式包括常染色体显性遗传型 （AD）、常染色体隐性遗传型 （AR）、X 连锁显性遗传型 （XLD） 和 X 连锁隐性遗传型 （XLR）。AD和AR是最常见的遗传模式（图1A），最常见的变异基因是SLC4A1和KMT2D，它们分别可导致两种最常见的疾病：dRTA（包含SLC4A1，ATP6V1B1和ATP6VOA4基因）和歌舞伎综合征。以高频率鉴定凹痕病（包含CLCN5和OCRL1基因）和原发性高草酸尿症（PH）（包含AGXT和HOGA1基因）（表2，图1E）。这些患者主要有NC或复发性结石。

表2 25例已知遗传病患者的基因型-表型相关性

基因型-表型相关性

参与尿酸化和高钙尿症失败的基因

值得注意的是，NL/NC的确诊临床诊断被发现与某些疾病有关，包括dRTA、牙本质病、X连锁低磷血症（XLH）、婴儿高钙血症和家族性低镁血症伴高钙尿症和肾钙质沉着症（FHHNC）（补充表3）。在所有患者中，LMWP的尿排泄显着增加（三例）。生长迟缓程度也显著（13例中有11例），患者更可能出现NC（卡方检验P = 0.0009）（图1F）。

在本研究中，六名临床诊断为dRTA的患者在SLC4A1，ATP6V1B1，ATP6VOA4基因中出现致病性变异。四名患者在CLCN5（OCRL基因）中具有致病突变，这与牙本质病相关，并且在一名诊断为XLH的患者中检测到PHEX基因的杂合突变。在一名患者中检测到CYP24A1基因的纯合子突变，并有助于婴儿高钙血症的诊断。在临床诊断为FHHNC的患者中检测到CLDN16基因的复合杂合突变。

在所有六名dRTA患者中均发现了致病性变异，由于血清阴离子间隙代谢性酸中毒，低钾血症和生长迟缓的表型，可以在临床上诊断。这些患者中的大多数患有NC或NC加NL，只有一名患者患有复发性结石。在携带SLC4A1基因致病变异的4例患者中，3例具有AD遗传，1例具有AR遗传。一名患者在ATP6V1B1基因中存在复合杂合突变，另一名患者在ATP6V0A4基因中存在复合杂合突变。

4例牙痕病患者均出现高钙尿症和LMWP，2例为CLCN5突变引起的Dent-1，2例为OCRL1突变引起的Dent-2。Dent-2患者在较年轻的发病年龄被诊断出来。其中两例患者在OCRL1基因中具有无意义突变p.K186X和p.L73X，生长发育滞后比CLCN5基因中两例错义突变p.C160R和p.C711R的患者更为突出。此外，发病年龄较年轻。

XLH、婴儿高钙血症和 FHHNC 具有特征性生化表型。所有三名患者均发病年龄较小。XLH患者弓腿，婴儿高钙血症患者肾钙化和肾功能丧失。

高尿症、胱氨酸尿症和高血糖素尿症基因

复发性结石见于大多数尿草酸盐、半胱氨酸和氨基酸排泄异常的患者。这些患者最终被诊断为胱氨酸尿症、原发性高草酸尿症（PH）和高血糖症（表2）。诊断为3例PH，2例胱氨酸尿，1例家族性肾糖尿。这些患者的发病年龄相对较年轻，中位年龄为 10.5 个月（5.5 个月，29.5 个月）。虽然没有明显的生长迟缓，LMWP或肾外表现，但大多数有复发性肾结石（P= 0.0289）（图1F）。NC是一个经常观察到的特征，在这些患者中被忽视。

在两名被诊断为PH III型（PH3）的患者中发现了HOGA1基因的致病性变异。结石分析提示草酸钙结石。值得注意的是，一名患者接受了微创手术，以去除引起梗阻的结石。诊断为PH I型（PH1）的患者年龄为4岁。在该患者中检测到移码突变p.T9Tfs * 159和错义突变p.G41R。患者在诊断时肾功能正常，并实施了维生素B6治疗，因为他出现了佝偻病的迹象。无法获得结石成分分析，然而，24小时尿液分析显示草酸水平显着增加。

分别对两名被诊断患有胱氨酸尿症的患者进行了基因突变SLC3A1和SLC7A9检测。结石的成分分析表明L-半胱氨酸。两名患者在两岁以下被诊断出来，没有观察到典型的鹿角结石。在摄入足够的水分和用柠檬酸钾口服治疗后，结石的大小在接下来的2年中没有增加。

其他基因和病毒

有趣的是，在我们的队列中，除了目前已知的单基因疾病外，还检测到两个基因和一个CNV以前没有被描述为引起NL / NC，这些基因和NC参与表观遗传修饰或可能导致智力迟钝。包括3例由KMT2D基因引起的歌舞伎综合征病例，1例KAT6A基因病例，以及1例chr10：05-130378377-135427935 q26.2-q26.3的5.05 Mb基因组样本病例。这类患者的中位年龄为9个月（3个月，58个月）。特殊表现，包括面部畸形，精神运动迟缓，CAKUT和其他器官（如心脏和髋关节）的先天性异常，是这些患者的常见临床表型（表2，补充表3）。

3例患者出现睑裂长、下外眼睑外翻、眉弓稀疏或分散的三分之一、鼻尖凹陷、耳朵大而突出，伴有轻度智力迟钝和先天性心脏病。其中1例为先天性髋关节脱位，超声均发现肾结石。KAT6A基因致病性变异患者表现为高弓、小下颌骨、耳廓异常、拇指内收和精神运动迟滞。然而，尽管临床外显子组测序未在一名具有特殊面部特征的患者中检测到致病性变异，但发现微缺失率为5.05-Mb。在这名患者中，我们检测到精神运动迟缓和CAUT和先天性心脏病。排尿性膀胱尿道造影（VCUG）提示IV级右侧膀胱输尿管反流（VUR），由于膀胱形态变化，患者怀疑有神经源性膀胱。急性肾功能衰竭发生在3个月大时因UTI，肾功能不能完全恢复到正常水平。

有一名患者的超声检查显示NC和NL。他被怀疑患有双侧肾微囊肿，后来被诊断出患有常染色体显性遗传性多囊肾病 （ADPKD）。根据患者在诊断时的年龄，没有注意到典型的肾囊肿。

未经证实的基因诊断

如补充表2所述，有7例患者怀疑患有遗传性NL/NC，临床和分子诊断未经证实，其中4例为NL，2例为NC，1例为NL加NC。观察到生长迟缓（两例，28.5%）和运动迟缓（一例，14.2%），但未检测到LMWP，电解质失衡和CAKUT。

讨论

近年来，儿童NL/NC的发病率呈上升趋势，发病年龄较小。儿童复发，遗传性NL或NC的风险很高，更常与肾功能受损有关（Zisman等人，2015）。

据 道，有30多个基因与NL / NC的单基因形式相关。检测单基因疾病基因中致病突变的能力具有重要的诊断和潜在的治疗重要性，因为在单基因疾病中存在几乎确定性的因果关系（Dhayat等人，2016;萨耶尔2017）。遗传研究表明，以下在肾结石的病因学中具有重要作用：转运蛋白和通道;钙传感受体信 通路;维生素D的代谢途径;草酸盐，半胱氨酸，氨基酸;嘌呤和尿酸）（嚎叫和塔克2020）。上述异常与单基因疾病有关。

许多中国学者通过建立多中心登记系统（中国儿童遗传肾脏病数据库，CCGKDD） 告了中国肾脏疾病儿童的遗传谱。根据他们的发现，诊断率为62.3%，表现为肾小管疾病或NC / NL（Rao等人，2019）。这些结果与我们 NL/NC 中心所达到的发病率相似。这种相似性可归因于适用于遗传学的筛选标准。

在我们对疑似遗传性NL / NC儿童的研究中，大多数患有NC或复发性结石的遗传性疾病。临床表现摘要显示，生长迟缓程度显著，低分子量蛋白尿排泄增加，高钙尿症，电解质失衡，发病年龄小。这些发现表明，生长迟缓和发病年龄小于 2 岁的显著程度可能是 NL/NC 病因的高危因素。

我们研究中主要存在的疾病包括dRTA，牙本质病，XLH，婴儿高钙血症和FHHNC。临床诊断可以通过临床表型得到支持和确认，但是，基因检测可以帮助识别分子诊断。这些信息可用于确定疾病的严重程度和预后，并有助于指导治疗并为患者提供遗传咨询。

一些临床特征，如血清阴离子间隙代谢性酸中毒正常、肾结石、骨软化症、生长迟缓和佝偻病，被认为是dRTA的特征和诊断。迄今为止，研究已经证实SLC4A1，ATP6V1B1和ATP6V0A4是dRTA的主要致病基因（洛佩兹 – 加西亚等人，2019;帕拉佐等人，2017）。SLC4A1基因变异患者可以AD / AR方式遗传，伴或不伴耳聋。相比之下，ATP6V1B1和ATP6V0A4基因只有AR遗传模式，这更有可能与感音神经性听力损失（SNHL）结合（巴尔加斯- 普苏等人，2006）。SLC4A1基因的遗传变异存在区域差异：高加索人主要 道AD遗传，而AD遗传和AR遗传主要 道东南亚（特别是在泰国），中国，韩国和日本（Alonso-Varela等人，2018;朴等人，2018）。

SLC4A1被认为是我们中心dRTA患者的主要基因。4例患者携带SLC4A1基因致病变异，3例具有AD遗传，1例具有AR遗传。如文献所述，遗传性AD患者的临床表型不如AR患者严重，并且发病年龄较大。被鉴定出p.G701D纯合突变的患者年龄最大，进展为CKD2。具有ATP6V1B1和ATP6V0A4基因变异的两名患者在诊断时都没有听力异常。对影响听力的因素进行随访至关重要。

对于牙本质病，据 道，30-80%的男性患者可能在30-50岁之间发展为终末期肾病（ESRD）。然而，在我们的研究中，所有四名患者的肾功能均显示正常，并在随访期间受到密切监测（Devuyst和Thakker 2010）。CLCN5p.C711R突变患者的临床表型不如p.C160R突变患儿严重。患者患有CLCN5 p。L73X，829在早期显示分离的蛋白质，肾活检检测到肾小球的轻微病变。这与文献中 道的内容一致（Blanchard等人，2016）。该患者在3岁时接受生长激素治疗，身高显著升高（1年内从83厘米升高至93厘米）。

所有牙本质病患者均注意到高钙尿症和 LMWP。然而，突变分析应该在具有这两个特征的患者中进行，无论是否存在结石或肾脏钙化（Hoopes等人，2005）。

在我们的中心，高钙尿症的比例很低，这可能与患者严格控制钙摄入量有关。在诊断的早期阶段或当肾小球滤过率（GFR）降低时，检测到大部分空腹尿钙/肌酐，这可能导致尿钙排泄被低估。当可用时，在随访过程中采用24小时尿钙测量。大多数儿童出现高钙尿症。

复发性结石、年轻发病生长迟缓、LMWP 和肾外表现在 PH、胱氨酸尿和高血糖尿症中不常见。对于这些类型的疾病，分子诊断对于确定病因很重要，尤其是在无法进行结石分析的情况下。因此，必须开发进一步有效的治疗方法，以保护可能接受多次手术的不同类型的肾衰竭患者。一些患者也可能迅速进展为 ESRD。

对于表明AR遗传模型的PH，PH1是最常见和最严重的类型，由AGXT基因突变引起，约占病例的80%。II 型 PH （PH2） 是由GRHPR基因突变引起的，而 PH3 是由HOGA基因的突变引起的。两者都表现出轻微的临床表型，表现为尿石症（Cochat和Rumsby 2013）。在我们之前的工作中，我们在诊断为PH3的患者中施用柠檬酸钾和水合作用，以减少他们额外结石的发展。此外，维生素B6疗法在PH1部分基因型患者中被证明是有效的。我们还对诊断为PH1的患者进行了维生素B6治疗，其肾功能应在下一阶段进行随访。

由于检测到SLC3A1和SLC7A9基因的变异以及提示L-胱氨酸的结石分析，两名明确诊断为胱氨酸尿症的患者接受了严格的碱化尿液治疗，因为他们太年轻而无法发展为典型的鹿角结石。在 2 年的随访中，结石进展非常缓慢。

除了目前已知的单基因疾病外，在我们的队列中还检测到两个基因和一个先前未被鉴定并表征为NL / NC致病的CNV。它们参与表观遗传修饰，有可能导致智力迟钝。这与3例由KMT2D基因突变引起的歌舞伎综合征病例、1例KAT6A基因突变病例和1例chr10：05 Mb基因组序列草案（chr10：130378377-135427935 q26.2-q26.3）有关。这组患者有特殊表现，包括面部畸形和精神运动迟缓（表2，补充表3）。对这类疾病表现的总结表明，面部畸形、精神运动迟缓、骨骼异常和身材矮小很常见，CAKUT更常见。所有这些主要表现，特别是对于相，绝对有助于诊断。NL的原因尚不清楚，然而，基因检测最终可以帮助确认诊断。

歌舞伎综合征由MLL2或KMT2D突变引起，具有与组蛋白甲基化相关的特征性表现，例如面部畸形。组蛋白甲基化是一种重要的表观遗传修饰，参与基因表达、发育和损伤反应的调节。目前的 道表明，歌舞伎主要与MLL2突变有关，MLL2突变参与肾功能，而KMT2D突变通常较少参与肾功能。以前很少有关于国民党2型糖尿病肾脏受累的 道。然而，在中国，国民党是肾功能相关性更强的基因。这与被诊断患有KMT2D突变的三名患者一致（Arnaud等人，2015）。然而，负责结石形成的确切机制仍然难以捉摸。肾脏超声显示，我们三名患者中有两名患者出现轻度肾发育不良，且无一例患者出现复发性 UTI。

在相当大比例的CAKUT患者中，罕见CNV的负担很高（Verbitsky等人，2019），然而，这些患者中NL的发病机制尚不清楚。这可能与复发性 UTI 和解剖异常有关。NL 相关合并症（如 UTI）可能特异性导致进行性肾损伤。

KAT6A基因编码赖氨酸乙酰转移酶，该酶是MYST蛋白质家族的成员。它形成组蛋白乙酰转移酶复合物的一部分，从而调节转录活性和基因表达，并可导致肾脏异常和复发性UTI。在本研究中评估的结石形成机制（Kennedy等人，2019）仍然难以捉摸。

本研究的结果表明，发病年龄小于2岁且临床表现与特定生化表型（如生长迟缓和骨质疏松症）相关的患者应紧急接受基因检测。然而，由于基因检测成本高昂，提出更可靠的基因检测标准来降低预期的自付费用具有重要意义。

建议符合以下三项或更多标准的NL / NC患者在我们的中心接受基因检测。标准的制定考虑了一些多中心队列研究的结果和对现有文献的回顾（Daga等人，2018;埃尔南德斯等人，2015;Shu 等人， 2017;通普拉永等人，2020），以及经济负担的现实（图2）。这些标准包括：（1）专利的年龄（<18岁）;（2）有NL/NC阳性家族史;（3）生长迟缓程度显著;（4）尿中低分子量蛋白质（LMWP）（尿β2-微球蛋白和α1-微球蛋白）的排泄;（5）特殊面部特征或骨骼异常;（6）代谢性酸中毒、代谢性碱中毒或血清电解质水平异常（不包括腹泻、呕吐等）;（7）诊断NC或多发/复发性NL;（8）肾功能异常（不包括感染或脱水引起的AKI）;（9）先天性肾脏和泌尿道异常;（10）产科异常的母亲;（11）精神运动迟缓。对于具有特定生化表型和肾外表型的患者，检测遗传诊断的机会最高。因此，我们的结果表明，当怀疑遗传性儿科NL / NC时，分子诊断很重要。此外，三重WES是一个有希望的选择，如有必要，应考虑CNV。我们中心分子诊断检测的高阳性检出率可能会减少错过随访的患者数量。因此，需要通过进行多中心队列研究来采用进一步的标准进行基因检测。

图 2

我们中心的肾结石（NL）/肾钙质沉着症（NC）患者的基因检测策略：显示NL / NC的代谢评估和基因检测标准的流程图

对于符合上述三项或三项以上纳入标准的患者，当在分子诊断测试中未发现致病性变异时，注意遗传性疾病的存在至关重要。因此，如果需要，建议强烈考虑临床表型，家族史随访，并使用进一步的先进分子诊断技术，如下一代测序（NGS），CNV和WGS（Groopman等人，2018）。

值得注意的是，一例高度怀疑患有肾小管疾病，其中初始超声检查未发现异常，而下一例则确认了NC的诊断。这种情况需要儿科医生和超声医师保持警惕，而显微CT成像可以使肾脏可视化具有更高的清晰度（Turk等人，2016）。

确诊的临床诊断可用于多种疾病，包括DRTA，牙本质病，X连锁低磷血症（XLH），婴儿高钙血症和家族性低镁血症伴高钙尿症和肾钙质沉着症（FHHNC）。基因检测可以帮助制定分子诊断，指导治疗以减缓结石和钙化的进展，并用于提供遗传咨询。当临床表型对诊断没有帮助，但高度怀疑遗传性肾小管疾病时，基因检测可能有帮助。对于某些疾病，基因检测也有助于排除肾移植复发的风险（AGXT或CLDN16等）。

对于我们的队列，在五名患者中，变异被定义为VUS。基因型和临床表型对应于家族的共分离，但不符合ACMG标准，被归类为致病性或可能致病性。1例疑似牙龈疾病患者携带CLCN5错义突变，1例疑似DRTA患者携带隐性基因ATP6V1B1中的2个复合杂合子错义突变，2例疑似胱氨酸尿和PH3患者携带1个隐性基因杂合性错义突变和1个可能致病性突变，检测到的CNV也定义为VUS。如果可能，应安排完成对错义变异体的功能研究。

结论

总之，我们的数据表明，在具有特定生化表型，CAKUT和肾外表型的患者中，检测遗传诊断的最高机会最大。NL/ NC的结果是可变的，从微不足道到CKD，并且由于其隐匿的发作而容易被忽视。由于复发风险显著且预后可能不利，所有NL/NC患儿都需要对临床表型进行全面评估，并且需要在遗传性疾病高风险患者中进行基因检测，以提供遗传咨询和适当的管理。因此，分子诊断测试的结果需要有关表型和家族史的全面而准确的信息（Johnson等人，2020），并且需要定期监测代谢评估。由于预期的自付费用，提出更可靠的基因检测标准具有重要意义。适当的诊断和基因检测标准是本研究的主要重点。

我们的研究结果表明，当临床诊断可以得到确认时，基因检测可以帮助制定分子诊断，指导治疗并提供遗传咨询。此外，基因检测还对32名病因不明的NL或NC患者中的17人进行了分子诊断。确认基因诊断有助于改善治疗方法，这也意味着在早期阶段开始适当的治疗，消除或减少长期并发症。此外，遗传信息的知识可以帮助咨询。我们的研究表明，在儿科NL / NC的背景下，WES或WES加CNV在诊断效用和患者管理中发挥着独特的作用。

本研究 告包含一些缺点。首先，尽管我们的目标是在这项研究中招募足够的患者，但样本量相对较小。其次，难以分析儿童结石成分可能会影响我们研究结果的可靠性。幸运的是，24小时尿液代谢分析可用于帮助此类问题。第三，虽然一些变异（错义突变）不符合ACMG指南提出的标准，但基因型和临床表型与家族共分离一致，表明这些变异需要功能分析。因此，有必要进行进一步的具有更大样本量的长期多中心队列研究，以确认我们的结果。