软骨特异性敲除SIRT1基因对小鼠椎体骨质疏松的影响及机制分析

单位：

1 长江航运总医院?武汉市脑科医院骨外科

2 长江航运总医院?武汉市脑科医院老年科

3 北京大学深圳医院脊柱外科?深圳市脊柱外科重点实验室

4 北京大学深圳医院骨科研究中心?深圳市骨科疾病再生技术工程实验室

引用信息：唐家国, 覃松, 王凯, 等. 软骨特异性敲除SIRT1基因对小鼠椎体骨质疏松的影响及机制分析[J]. 生物骨科材料与临床研究, 2021, 18(3): 30-35.

文章导读

近年来，关于基因因素对骨质疏松的影响研究成了热门话题，笔者将小鼠分为软骨SIRT1基因未敲除组和软骨SIRT1基因敲除组，测定SIRT1基因的表达情况及相关骨代谢指标，最后证明SIRT1是骨量的积极调节者，是开发骨质疏松症的新疗法的一个有希望的靶点。

摘要

目的　探讨沉默信息调节因子（SIRT1）基因对小鼠椎体骨质疏松的影响。

方法　将小鼠分为两组：软骨SIRT1基因未敲除小鼠组(A组，n=7)；软骨SIRT1基因特异性敲除小鼠组(B组，n=7)。利用荧光定量聚合酶链反应及SIRT1免疫组化检测SIRT1基因的表达情况；通过对两组小鼠尾椎行Micro-CT扫描量化骨量体积百分比、骨小梁数量和骨小梁的厚度的改变；再采用HE染色、Masson染色评价椎体骨质结构的改变。

结果　B组小鼠SIRT1 mRNA表达量为(2.61±1.11)，明显低于A组(8.08±1.64)(P<0.01)；B组SIRT1蛋白的免疫组化染色积分为(3.10±2.69)，明显低于A组(5.07±2.99)(P<0.01)。Micro-CT结果显示，A组小鼠骨量体积百分比为(37.96±8.54)%，显著高于B组的(28.39±6.27)%，差异有统计学意义(P<0.05)；A组小鼠骨小梁数目(5.76±0.63)显著高于B组(5.15±0.50)，差异有统计学意义(P<0.05)；两组小鼠的骨小梁厚度差异无统计学意义(P>0.05)。HE染色和Masson染色结果显示，A组椎体骨质较B组明显密集。

结论　SIRT1基因敲除减少了小鼠椎体骨量体积百分比、骨小梁数量，因此SIRT1基因可能对小鼠椎体骨量调节具有积极的作用。

关键词：沉默信息调节因子1（SIRT1）；基因敲除；骨质疏松；动物实验研究

骨质疏松症（osteoporosis）是绝经后妇女和老年人常见的代谢性骨病[1]。骨质疏松症的病理特征包括骨量减少、骨微结构异常、骨密度降低、骨脆性增加，导致骨折的风险增加[2]。据估计，目前全球约有2亿人患有骨质疏松症，美国约有3 400万患者被诊断患有骨质疏松症或低骨量[3]。骨质疏松症可引起疼痛、脊柱畸形和脆性骨折。脆性骨折通常是由低能量的冲击造成的，如从站立高度跌落、轻微碰撞或其他常规的轻伤。在50岁的妇女中，发生骨质疏松性骨折的风险可能高达50%[4]。椎体骨折是常见的骨质疏松性骨折。椎体骨折可引起长期疼痛，严重影响患者的生活质量，甚至可增加死亡的风险[4]。因此，骨质疏松症已成为世界范围内的一个主要公共健康问题[3]。但是，目前关于骨质疏松症的治疗还没有金标准。近年来，关于基因因素对骨质疏松的影响研究成为了热门话题。

沉默信息调节因子1(silent information regulator 1, SIRT1)是一种Ⅲ型乙酰转移酶基因，已在哺乳动物中得到深入研究。最近的研究确定SIRT1在代谢疾病、退行性疾病、癌症和衰老的病理生理学中起着至关重要的作用[5]。有研究 道，SIRT1基因在骨质疏松患者的外周血单核细胞的细胞核及细胞质中表达均增高[6]。目前有研究证实，在前成骨细胞中特异性敲除SIRT1基因，对骨松质的体积没有明显影响，而在成熟的成骨细胞中特异性敲除SIRT1基因，则会导致骨松质的体积明显地减少[7-9]；相反，SIRT1基因的激活或过表达，会出现因年龄增加而导致的骨质丧失减少。骨折作为骨质疏松最常见的并发症之一，严重椎体骨折可能导致截瘫[10]。而手术是治疗骨质疏松性骨折的主要方法，虽然像椎体骨质疏松性压缩性骨折手术治疗具有操作简单、恢复迅速和手术时间短等优点。但是并没有解决骨质疏松性骨折的根本问题[11]。因此，预防和早期治疗骨质疏松具有十分重要的临床意义。

骨质疏松症被广泛认为是一种典型的衰老相关疾病，而SIRT1是细胞生存和寿命的重要调节因子[12]。SIRT1参与了众多的生物学过程，包括DNA修复、能量代谢、肿瘤抑制和线粒体内稳定等，成为近年来的研究热点[13]。有研究表明，SIRT1基因与骨代谢和骨量关系密切[14]。

在本研究中，笔者使用Cre-Lox系统对小鼠软骨中SIRT1基因特异性敲除构建（SIRT1cKO）小鼠，分为SIRT1基因未敲除与SIRT1基因敲除的两组小鼠模型，对两组小鼠尾椎通过Micro-CT扫描，对尾椎骨小梁数量、骨小梁的厚度、骨量体积百分比进行量化比较。再采用HE染色、Masson染色评价椎体骨质结构的改变，通过比较两组小鼠尾椎椎体骨质改变情况，从而探讨SIRT1基因对小鼠椎体骨质疏松的影响。

01、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

用Col2a1-CreERT2转基因小鼠与SIRTlCO/CO小鼠杂交获得SIRT1+/+小鼠，两种小鼠均从美国杰克逊实验室购买。实验中使用的小鼠被安置在北京大学香港科技大学医学中心的实验动物中心的单独通风鼠笼中特定的无病原体(specific pathogen free, SPF)屏障区域，处于12 h光照/12 h黑暗周期下，在环境控制的房间中进行常规通风。所有的小鼠都可以自由获取食物和无菌水。所有实验程序和小鼠治疗均按照实验动物管理规定进行。

1.1.2 主要仪器

高速冷冻离心机（SIMA公司，德国），光学显微镜（Leica公司，德国），PCR热循环仪（Eppendorf公司，德国），凝胶成像系统Dolphin-DOC（Weahec公司，美国），包埋切片机（Skura公司，日本）。Micro-CT （SCANCO Medical AG 公司，瑞士，μCT100，深圳市弗劳恩科技服务有限公司），ABI Prism 7000型荧光定量PCR仪（ABI公司，美国）。

1.1.3 主要试剂

SIRT1一抗（Abcam公司，美国），他莫昔芬、玉米油（Sigma公司，美国），TRE-trizol（Invitrogen公司，美国），Fast Green Solution、Safranin O Solution（Scytek公司，美国），PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、SYBB Premix Ex Tap II（Takara公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 建立软骨特异性敲除SIRT1基因小鼠模型

实验小鼠的繁殖参考于菲等[15]在利用SIRT1基因敲除建立小鼠膝骨关节炎模型的研究中的繁殖方法。通过SIRTlCO/CO小鼠和Col2a1-CreERT2转基因小鼠先分别分笼进行繁殖，按照1只SIRTlCO/CO雄鼠和1只SIRTlCO/CO雌鼠合笼、1只Col2a1-CreERT2雄鼠和1只Col2a1-CreERT2雌鼠合笼的方式进行繁殖。待SIRTlCO/CO小鼠和Col2a1-CreERT2小鼠繁殖到20只以上，按照1只SIRTlCO/CO雄鼠与1只Col2a1-CreERT2雌鼠通过合笼的方式进行繁殖得到SIRT1+/+小鼠，SIRT1+/+小鼠繁殖到20只以上时正常条件下饲养，饲养至8个月龄，然后向SIRT1+/+小鼠腹腔注射他莫昔芬10 mg/mL，75 mg/kg体重，每日1次，连续注射5 d，即获得SIRT1-/-小鼠。

1.2.2 实验分组

将14只Col2a1-CreERT2转基因小鼠按随机数字表法分成A组对照组（SIRT1+/+小鼠组）与B组敲除组（SIRT1-/-小鼠组），每组7只，B组小鼠进行上述方法进行软骨特异敲除性SIRT1基因。同时对A组小鼠进行等剂量的玉米油腹腔注射。在他莫昔芬注射完毕8周后，通过颈椎脱臼法处死，留取尾椎（Co5-Co9）标本，10%福尔马林溶液固定后石蜡包埋。

1.2.3 软骨特异性敲除SIRT1基因小鼠的基因表型通过荧光定量PCR反应鉴定

通过NCBI 站GeneBank查询SIRT1基因序列如表1所示，使用Primer Premier 5.0软件进行引物合成。采用逆转录试剂盒进行cDNA合成。根据SIRT1基因的退火温度选择三步法完成扩增，经过44次循环。扩增产物的特异性依据溶解曲线判断，内参为GAPDH。以TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II(Perfect Real Time)试剂盒说明作为反应参数，数据分析采用Bio-Rad CFX Manager Software1.6系统及2-ΔΔCt的方法进行。

1.2.4 Micro-CT扫描检测

将两组小鼠尾椎标本保存于10%福尔马林溶液中固定24 h，然后整洁摆放在Micro-CT扫描专用管中，扫描参数为：55 kV的峰值电压，200 μA的电流，11.4 μm的扫描层分辨率，再采用计算机软件对骨小梁数量、骨小梁的厚度以及骨量体积百分比进行定量分析。

1.2.5 骨组织比较

组织标本在10%多聚甲醛中固定24 h，脱钙并石蜡包埋，连续切片，片厚5 μm，行HE染色和Masson染色。

1.2.6 免疫组化染色

组织标本在10%多聚甲醛中固定24 h，脱钙并包埋在石蜡中。获得了连续的5 μm切片。组织切片在65℃烤箱烘烤3 d，用蒸馏水冲洗2次，然后进行抗原修复。切片用PBS洗涤3次，用过氧化物酶阻断剂处理，再用PBS洗涤3次。切片用非免疫动物血清处理，然后与SIRT1抗体一起孵育。切片用PBS洗涤3次，然后用二抗孵育。切片用琼脂溶液处理，然后用两滴新鲜的琼脂溶液处理。

1.2.7 免疫组化结果评定

免疫组化结果评定参考于斐等的研究[16]，在显微镜下，对SIRT1抗体呈免疫组化阳性的细胞被染成棕色。将染色强度分为4级（见表2），以每张切片中所见的阳性细胞范围分为5级（见表3）。每张切片染色积分以两者乘积表示。评分人员按评分标准均进行双盲评分，数据为两次评估的平均值。

1.3 统计学方法

运用SPSS 17.0软件进行数据统计分析。计量资料应先进行正态性检验，结果符合正态分布，用均数±标准差表示，采用t检验对两组数据进行的统计学分析比较。P<0.05为差异有统计学意义。

02、结果

2.1 SIRT1基因敲除的鉴定

剪取两组小鼠尾尖软骨组织提取DNA，两组小鼠基因表型采用荧光定量PCR反应鉴定。结果显示A、B两组小鼠SIRT1 mRNA表达量分别为(8.08±1.64)、(2.61±1.11)，差异有统计学意义(P<0.01)（见图1）。两组小鼠SIRT1表达趋势的电泳图如图2所示。证实B组小鼠软骨组织中SITR1基因敲除成功。

图1

图1 SIRT1基因在两组小鼠中的表达
注：**表示两组比较，P<0.01。

图2

图2 实验中两组小鼠SIRT1基因表达的电泳图

2.2 SIRT1的免疫组化结果

SIRT1抗体在小鼠尾椎椎间盘髓核内免疫组化染色积分，A组为(5.07±2.99)、B组为(3.10±2.69)。B组与A组比较差异有统计学意义，(P<0.01，见图3)。

图3椎间盘髓核组织免疫组化中SIRT1的表达情况（×400）：A. A组小鼠模型中髓核组织中SIRT1的表达情况；B. B组小鼠模型髓核组织中SIRT1的表达情况
注：黑色箭头为阳性细胞。

2.3 Micro-CT结果

两组小鼠的尾椎标本通过Micro-CT扫描分析得出的骨量体积百分比(Bone volume/ Total volume, BV/TV)，骨小梁数目(Trabecular number, Tb.N)，骨小梁厚度(Trabecular thickness, Tb.Th)相关数据（见表4）。B组小鼠骨量体积百分比显著高于A组小鼠，差异有统计学意义（P<0.05）；B组小鼠骨小梁数目均显著高于A组小鼠，差异有统计学意义（P<0.05）（见图4）；A、B组小鼠骨小梁厚度比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

注：A组为SIRT1基因未敲除组，B组为SIRT1基因敲除组；*与A组比较，P<0.05。

图4

图4 两组小鼠骨量体积百分比、骨小梁数目的比较
注：*表示两组比较，P<0.05。

2.4 椎体骨改变情况

Micro-CT扫描后三维重建得出A组和B组小鼠的椎体骨改变情况，可以看出B组小鼠椎体中央或整个区域松质骨密度较A组减低，并成蜂窝状或不规则片状低密度改变（见图5）。

图5

图5 MicroCT三维重建图：A. A组小鼠模型的三维重建图；B. B组小鼠模型的三维重建图

2.5 骨组织切片结果

骨的组织学切片对比，A组小鼠椎体骨组织较B组骨质分布更密集（见图6）。

图6

图6 两组小鼠椎体骨组织表现：A. A组在100倍镜下的HE染色；B. A组在200倍镜下的HE染色；C. A组在200倍镜下Masson染色，椎体骨组织均表现为骨小梁变薄、骨间隙增大；D. B组在100倍镜下的HE染色；E. B组在200倍镜下的HE染色；F. B组在200倍镜下Masson染色，均可以显示A组小鼠椎体骨组织较B组骨质分布更密集

03、讨论

随着我国逐步进入老年性 会，骨质疏松的发病人数逐年升高。由于骨量减少、骨微结构破坏、骨强度降低及骨脆性增加，骨质疏松患者极易发生骨折，严重者可引起患者股骨头坏死、瘫痪，甚至死亡[17]。而手术是骨质疏松性骨折目前最有效的治疗方法，然而骨质疏松性骨折患者以老年人居多，术后的恢复非常缓慢[18]。同时，给患者家庭和 会带来了沉重的经济负担[3]。因此，从基因方面治疗或者延缓骨质疏松的进展，以及减少骨质疏松性骨折的发生具有十分重要的意义。

有学者进行体外实验证实特异性敲除间充质干细胞的SIRT1基因，可抑制间充质干细胞向成骨和成软骨方向分化[7]。而本实验研究中通过Micro-CT扫描得到A、B两组小鼠的骨量体积百分比、骨小梁数目和厚度以及三维成像下等数据进行相互比较，并通过椎体骨组织的HE染色及Masson染色进行骨组织学对比，发现软骨特异性敲除SIRT1基因组小鼠导致骨微结构恶化，表现为骨小梁变薄、骨间隙增大和骨密度降低。同时，笔者的实验结果也证实了上述文献 道的SIRT1基因的敲除导致骨质丧失的现象。

近年来，与骨代谢相关的分子信 通路成为研究热点。研究表明，与骨质疏松相关的信 通路包括Wnt/β-catenin、RANKL/RANK/OPG、NF-κB、PPAR-γ、PTH、MAPK、pi3k/Akt、Hedgehog和Notch信 通路[19]。白藜芦醇作为SIRT1基因的激动剂[20]，目前在研究SIRT1基因对骨质疏松的作用机制中得到广泛应用。有体外实验研究[21] 道，间充质干细胞通过白藜芦醇处理后会促进细胞的成骨向分化。同时，也有体内实验研究表明[22]，通过药物激活SIRT1保护绝经后骨质疏松症和衰老相关骨质疏松症的小鼠模型的骨质疏松症。经SIRT1激动剂治疗后，骨量显著改善。目前，SIRT1基因激动剂白藜芦醇已用于人体试验，可显著增加老年肥胖男性的骨量[23]。第四军医大学西京医院的研究通过白藜芦醇对大鼠骨质疏松模型的作用机制研究中证明了藜芦醇调节SIRT1-NF-kB信 通路，促进成骨细胞分化，预防骨质疏松症[24]。近期也有研究 道，通过白藜芦醇激活SIRT1/FoxO1信 通路促进小鼠骨质疏松模型骨质生成，对骨质疏松起到保护作用[25]。本研究中利用特异性敲除软骨SIRT1基因，导致小鼠尾椎骨质流失增加，可能阻断或减少了SIRT1基因对SIRT1-NF-kB信 通路、SIRT1/FoxO1信 通路及其他骨代谢通路的激活，减少成骨细胞分化，导致骨质疏松的形成。然而，每个骨代谢的信 通路并不是单独存在的，更常见的是多条通路相互交叉共同调节骨代谢。也有可能还存在未知、潜在的骨代谢信 通路，这需要我们下一步实验证实。

然而，这项研究有一定的局限性。骨矿物质形成和成骨细胞分化的调节是复杂的。在这项动物实验体内研究中，笔者只检测了SIRT1基因敲除对小鼠尾椎骨质疏松的影响，而没有研究SIRT1基因激动剂对小鼠骨质疏松的影响。另外，笔者未对骨质疏松调节的分子通路进行研究，我们需要进一步探索SIRT1基因对骨量调的分子机制。

综上所述，笔者目前的研究证实SIRT1基因对小鼠尾椎骨质疏松具有保护的作用。这些发现提供了强有力的证据，证明SIRT1是骨量的积极调节者，是开发骨质疏松症的新疗法的一个有希望的靶点。

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