RPA检测方法研究进展

重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase polymerase amplification, RPA）是近年来兴起的一种等温核酸扩增技术。RPA引物探针设计要求简单，能在37℃~42℃的温度实现扩增，利用重组酶与引物结合并寻找与引物互补的同源序列，解锁局部双链DNA，不需要对模板高温变性，20~30分钟可获得大量扩增产物。反应时间长短取决于起始模板拷贝数和扩增子大小。RPA一般耐受有3~5个错配的碱基，即不影响RPA反应性能。此外，该技术比其他DNA扩增方法具有降低基质相关抑制剂影响的潜力。与传统方法相比，该方法具有反应温度低、反应时间短、不需要昂贵设备等优点，试剂是冻干粉形式，不需要冷链储存，操作更简单，结果可通过凝胶电泳或实时监测荧光信 进行分析。总的来说，RPA检测方法有利于广泛开发用于现场及实验室病原微生物的检测。

一

RPA检测方法概述

RPA是当下发展较快的恒温扩增技术之一，可以在恒定温度（37~42℃）下实现指数扩增，无需对DNA样品进行热预处理，其摆脱了精密温度循环系统，更加有利于基层的推广和应用。2014年以来，英国TwistDx公司开发RPA检测试剂盒加快了RPA技术的迅猛发展。目前英国TwistDx公司开发的RPA商品化试剂盒主要有六种，即TwistAmp Basic、TwistAmp Basic RT、TwistAmpexo、TwistAmpexo RT、TwistAmpfpg、TwistAmpnfo。

Basic是RPA试剂盒的基础款，包含扩增反应所需的所有酶和试剂，实验需要准备引物和模板，结果通过琼脂糖核酸凝胶电泳方法读取；Basic RT除包含Basic试剂盒中的成份外，还包含逆转录酶，适用于以RNA为模板的核酸扩增，实验需要额外准备RNA酶抑制剂；exo属于实时荧光型，需要设计exo探针，包括荧光基团（Carboxy Fluorescein, FAM）、猝灭基团（Black Hole Quencher, BHQ）及两个基团之间的四氢呋喃（Tetrahydrofuran, THF），3’末端标记一个修饰基团C3-spacer，实验中添加核酸外切酶对THF进行切割，分离FAM和BHQ后产生荧光。所以exo方法只适合实时荧光的检测；exo RT和exo区别在于以RNA为模板的荧光核酸扩增；fpg也属于实时荧光型，fpg酶切割的是dR基团，保证fpg探针和扩增子依然完好，因此该方法结果可以通过荧光机器和凝胶电泳分析；nfo结果通过测流层析试纸条分析。这些试剂盒适用以DNA或RNA的扩增反应，结果可以通过核酸电泳、荧光和试纸条多种形式呈现。

二

RPA检测方法原理

RPA技术主要酶试剂包括：重组酶、单链DNA结合蛋白（singlestrand binding, SSB）和链替换DNA聚合酶，酶活性对温度要求不高，最佳条件范围为37℃~42℃。重组酶作用是催化引物与同源序列结合，如T4噬菌体UvsX蛋白、RecA及其他经过工程菌改造和修饰的重组酶。重组酶与引物杂交形成核蛋白复合体后，开始搜索模板双链DNA中的同源区域，一旦同源序列被定位就会形成D-loop型结构。SSB主要来自T4噬菌体的gp32蛋白或其衍生物。当核蛋白复合体和模板DNA中的同源链形成D-loop型结构后，单链DNA另一侧结合SSB保持结构稳定，防止引物的脱落。聚合酶主要来自枯草芽抱杆菌Bsu蛋白、Bst蛋白等。引物与模板链杂交后，重组酶从核蛋白复合体上脱离，在D-loop型一侧引发链置换反应，聚合酶Bsu随即结合在引物的3’端进行核酸分子指数扩增。除此之外，重组酶装载因子（主要来自T4噬菌体的uvsY蛋白）以及拥挤试剂（crowding agent Carbowax20/聚乙二醇PEG）在构建最优的RPA反应环境也起到重要作用。二者可以改变反应动态平衡，使其朝着有利重组酶装载的方向发展。

三

RPA技术的应用现状

目前，RPA技术在病原检测方面研究较多，已经建立了针对细菌、病毒、寄生虫等多种病原体诊断方法。此外，RPA技术在食品安全方面可以用于检测转基因成分以及可以用于癌细胞检测、基因突变等多方面。检测样品类型也多种多样，涉及到动、植物样品等各个类型，在诸多方面取得一定的成果，展现出了良好的应用前景。

1. RPA技术在病毒检测方面的应用

在动物病毒检测方面，已经建立起了多种RPA检测方法。猪病病毒如非洲猪瘟病毒、猪细小病毒、猪蓝耳病病毒；反刍动物病病毒如口蹄疫病毒、羊口疮病毒、牛冠状病毒；禽病病毒如H5N1、H7/N9等不同亚型；水生动物病毒如白斑综合症病毒、传染性皮下和造血器官坏死病毒、锦鲤疱疹病毒。这些检测方法在30分钟内就能完成，检测限在10~1000个拷贝之间。植物病毒如Londono等通过RPA方法检测黄叶卷曲病毒等。对于人类病毒性疾病的RPA检测方法，如RPA可以在20分钟内检测到低拷贝量的HIV-1 RNA，适合非洲地区户外检测使用；Faye等建立了埃博拉病毒RT-RPA方法，可以短时间检测到低至15拷贝的核酸分子。

2. RPA技术在细菌性病原检测方面的应用

相对于病毒检测，细菌检测大多数是通过传统的分离培养鉴定，这种方法不仅耗时耗力，而且操作过程中可能会对实验人员安全产生一定的威胁。因此，建立快捷准确的分子检测技术对于细菌病原鉴定有现实意义。细菌RPA技术检测最早应用于耐药性金黄色葡萄球菌的研究。之后采用exo-RPA、LF-RPA等多种技术，检测布鲁氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、阪崎克罗诺杆菌、空肠弯曲杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等，检测灵敏度好，特异性强，反应时间短，比较适合资源有限的现场检测，具有良好的应用前景。

3. RPA技术在检测寄生虫方面的应用

寄生虫病严重危害畜禽养殖业，通常对其早期诊断主要依靠临床表现或者从动物分泌物等分离观察卵或者幼虫。RPA技术作为快速准确的现场检测方法，在早期寄生虫检测方面具有很大的优势。已有关于研究贾第鞭毛虫、阿米巴虫、恶性虐原虫等的RPA检测方法的 道。

除了上述三大主要类别的检测，还有关于动物支原体的检测如山羊支原体、猪肺炎支原体、绵羊肺炎支原体等通过exo-RPA以及LF-RPA技术，为支原体感染的诊断提供便捷的方法。常见病原经常性会混合感染，所以RPA检测技术不会局限于单一的病原检测，有望向着多重检测方向发展，扩大检测的范围。如Kersting等、Choi等、Euler等分别建立了关于不同细菌和病毒的多重RPA检测技术。

此外，检测结果形式也不局限于荧光检测或者试纸条检测，已有将RPA技术和固相芯片技术、微流体数字化、电化学等其他技术相结合。在不同领域中朝着高通量以及快速检测的方向发展。如Santiagofelipe等利用RPA和ELISA结合，探针在微孔板上反应之后用比色法检测花生、玉米、大豆等作物的过敏原和转基因；Shin等结合RPA和ISAD检测癌症单碱基突变。微流体技术是将样品准备和分子扩增检测结为一体的技术，简化了试剂准备过程，利于RPA大规模使用。如Lutz等结合RPA和微流体芯片进行全自动分析；Kersting等将微阵列技术和多重RPA结合；Tsaloglou等结合RPA和微流体滑动芯片。RPA-微流体技术集成度较高，但是程序复杂、成本较高。目前进行现场推广可行性不大，但是该技术是实验全自动化的一个重要方式，解决现有问题之后，该技术更适用于非专业人员操作以及资源短缺的情况。这些研究都是为了增加该技术实现现场快速检测的可能性。

四

总结和未来展望

与其他等温扩增技术相比，RPA优点是可以在温度范围37~42℃条件下工作，不需要严格控制内部温度，这是一个不同于其他等温技术的重要特点。RPA还具有便捷、高灵敏性和特异性、扩增效率高、实验设计简单等优点。即使存在一些已知的PCR抑制剂或粗提物，RPA也能在20分钟的时间内扩增出低至1~10个目标拷贝，而且可以扩增不同种类生物的RNA和DNA靶标。此外，RPA试剂以冻干的形式保存，室温保存至少为6个月，而其他的等温技术试剂都需要冷藏，现场应用受限。RPA检测技术在分子诊断、食品质量控制、环境分析等方面具有广阔的发展和应用空间。目前还没有针对RPA特异性引物设计的软件，因此需要较长时间优化引物序列。不同的DNA靶标，即使有相同的GC含量、引物熔化温度和扩增子长度，扩增的效率也会有很大的不同。所以开发一款简化RPA探针和引物的设计和筛选软件具有较大的意义。此外，目前RPA试剂成本比PCR高，但其时间与人力成本相对较低，未来可通过条件优化降低试剂成本，获得更加完善的反应体系，将有广阔的应用空间。

文｜广东省农业技术推广中心 姜志勇 文华康

中国水产科学研究院珠江水产研究所 渠洋 王庆

文章摘自 2022年第1期《海洋与渔业》杂志