专题 道 || 涉案偶蹄目动物 DNA 条形码构建

论文推荐

涉案偶蹄目动物 DNA 条形码构建

刘大伟，侯森林*，周用武，费宜玲，何 建

南京森林警察学院，野生动植物物证技术国家林业和草原局重点实验室，国家林业和草原局森林公安司法鉴定中心。

在野生动物案件中,涉案物件往往是动物残体或者经过加工的制品,与原动物相比,这些物品在形态上已经显著改变或完全丧失,通常从外形不能对其进行准确鉴定,对涉案动物进行科学准确的物种识别与鉴定至关重要。DNA条形码是应用足够变异、容易扩增且相对较小的标准DNA片段对物种进行快速、准确的生物身份识别系统。相较于传统的形态学鉴定, DNA条形码技术具有不受物种外观形态影响,操作简单,易于标准化,通用性和准确性高等优点。目前,该技术已广泛应用于多种动植物种的快速鉴定。理论上,一条短的DNA序列就能够将所有物种区分开来,但目前不同的研究者根据其研究对象自身的生物学特性以及不同的研究目的独自建立适宜的条形码,尚无统一的生物物种DNA鉴定系统,较难实现简易快速鉴定。在多数动物类群中,基于线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)的DNA条形码技术被认为是行之有效、通用的标准条形码片段。然而,也有学者指出在某些低等动物种类和鸟类中，该基因进化速度缓慢,突变速率较低,在物种鉴定方面不如其他基因稳定,因此针对这一类群的动物应谨慎选择COI基因片段。细胞色素b(Cyt b)是线粒体自身编码的功能蛋白之一。相比于COl 、Cyt b基因片段的优点在于其结构和功能研究的比较清楚,进化速率适中,使用通用引物对其扩增和测序较为容易,部分片段就能够包含种内、种间、甚至科间的遗传信息,因此该片段是解决物种鉴定问题的重要分子标记。在一些研究中,常将这两个基因片段联合使用进行物种鉴定。

下面跟学 君一探究竟！

关键词：偶蹄目；DNA条形码；物种鉴定

基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金项目(LCYB202007);“十三五”江苏省重点建设学科项目(2016-2020)。

引文格式：刘大伟,侯森林,周用武,等.涉案偶蹄目动物DNA条形码构建[J].南京林业大学学 (自然科学版）,2020,44( 6):27一32.LU D W,HOU SL,ZHOU Y W, et al.DNA barcoding of Artiodactyla in cases involved in wildlife for species identification [J].Joumal of Nanjing Forestry University (NaturalSciences Edition ) , 2020,44(6)
:27-32.DOI:10.3969/j.issn.1000-2006.202004013.

1目的

利用线粒体DNA条形码标记鉴定涉案偶蹄目动物,为解决偶蹄目动物残体、制品的鉴定难题提供技术参考。

2方法

对16个偶蹄目动物物种,共67份样本采用试剂盒提取DNA,扩增、测定物种的线粒体DNA的COI基因、Cyt b基因片段;在GenBank上 Blast搜索进行同源性分析;利用MEGA7.0软件分别比较这两个基因片段种内和种间遗传距离,构建系统发育树。

2.1 研究样品

研究材料均来自国家林业局森林公安司法鉴 定中心保存的已知物种的肌肉、毛皮、骨和角，共 67份，分属 16个物种，具体信息见表1。

▼表 1 涉案动物样本信息

?注：I、II表示该物种被列入《国家重点保护野生动物名录》一级、二级。“三有”表示该物种被列入《有重要生态、科学、 会价值的陆生野生动物名录》。

2.2 DNA 提取及 PCR 扩增

针对不同状态的样本采取不同的取样方法。肌肉和毛皮组织使用眼科剪剪取约25 mg,置于1.5 mLEP管中。骨和角采用电钻钻取约20mg粉末,置于1.5 mLEP管中。所有样品的基因组DNA提取均采用DNA提取试剂盒(‘Takara公司)，具体方法参考试剂盒说明书。其中,H当DNA提取时,消化时间延长至24 h。提取的总DNA置于TE缓冲液中-20 ℃保存。

根据偶蹄目动物线粒体DNA COI和Cyt b基因特征,选取保守区域序列,使用Primer premier5.0软件设计引物。COIF:5′-TTGAAGCYGGAG-CAGGAACAG-3’。COI R:5’一AARTAGGCTCGT-GTCTCRAC-3’。产物长度为561 bp。Cyt b F:5′-CCAGCCCCATCAAAYATCTC-3’。COI R:5′-TTG-GATCCTGITICGTCGAG-3’。产物长度为553 bpo所有PCR反应体条为25uL，1H Vel程仪(美国AB公司)上完成。COI和Cyt b的反应程序均为:94℃预变性2 min;94 ℃变性30s,55 ℃退火40 s,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃延伸8 min。扩增产物经1%琼脂糖电泳检测,条带清晰的产物采用Sanger法进行双向测序。

3结果

在同源性分析中,西伯利亚孢(Capreolus pygargus)的Cytb基因片段与GenBank中西伯利亚孢、欧洲狗(Capreolus capreolus)的基因序列的同源性均为99.64% ~99.82%，该片段不能区分西伯利亚孢与欧洲孢这两个近缘种。其余测序结果与数据库中参考序列一致且相似度较高。对于COI片段,种内遗传距离为0~1.4% ,种间遗传距离为1.8%~18.8%。对于Cyt b基因片段种内遗传距离为0~0.5%,种间遗传距离为4.0%~15.8%。两个片段的种内遗传差异均小于种间遗传差异,存在较为明显的条形码间隔。COI和Cyt b的系统发育树中,同物种的不同个体均能形成具有较高支持度的单分支;不同物种之间界限清晰,每个物种的所有个体均能够形成具有较高支持度的单分支。

3.1 基于Bast比对的物种鉴定

将测序所得的COI和Cyt b 基因序列在Gen-Bank中进行Blast比对发现,西伯利亚孢的Cyt b基因片段与GenBank中西伯利亚孢、欧洲孢的基因序列的同源性均为99.649%~99.82%(表2),该片段不能区分西伯利亚孢与欧洲孢(Capreolus capreolus)这两个近缘物种。其余测序结果与数据库中参考序列一致且相似度较高。测得的序列均为两个基因真实的序列。

▼表 2 涉案动物的 COI和 Cyt b基因片段比对结果

3.2 基于遗传距离分析

在两两个体遗传距离比较中,种内COI和Cyt b基因片段均有121对参与比较,种间有2090对参与比较。结果表明,对于COI片段,种内遗传距离为0~1.4%(平均值为0.1%),其中最大值为2个马鹿个体比较结果;种间遗传距离为1.8%~18.8%(平均值为12.1%)。对于Cyt b基因片段种内遗传距离为О~0.5%(平均值为0.04%),其中最大值为4个黑麂个体之间比较结果;种间遗传距离为4%~15.8%(平均值为10.9%)(表3)。

▼表 3 涉案动物的COI和 Cyt b基因序列的基因片段的种内、种间遗传距离

经分析,COI和Cyt b片段在16个偶蹄目动物物种,67份样本中种内遗传差异均小于种间遗传差异,存在着明显的条形码间隔(图1)。

▲图 1 涉案动物的COI和Cyt b基因片段种内和种间遗传差异分布

3.3 基于系统发育树分析

使用Mega7.0软件分别构建了COI和Cyt b 的系统发育树(图2)。两个片段的发育树均表明,同物种的不同个体均能形成具有较高支持度的单分支,且不同物种间界限清晰,这表明两个片段均能够较好地区分物种。

▲图 2 基于 COI片段（左）及 和Cyt b 片段（右）构建的遗传距离邻接（NJ）树

4结论

研究表明,基于COI,Cyt b基因片段构建的DNA条形码均可对涉案偶蹄目动物进行物种鉴定。在物种鉴定中,为了降低错误风险可采用两个片段联合使用的方式,尤其是对于近缘种的鉴定。

关注我们，更多精彩