通过引物延伸测序分析具有选择性羟基酰化作用的多重RNA结构

抽象

天然的和工程化的非编码RNA都不断出现新的调节作用，其中许多具有特定的二级和三级结构对其功能至关重要。因此，越来越需要开发能够快速表征复杂RNA群体内结构特征的技术。我们已经开发了一种高通量技术SHAPE-Seq，它可以同时测量数百个任意序列RNA分子的定量，单核苷酸分辨率二级和三级结构信息。形状SEQ联合收割机小 择2′- ? ydroxyl 一个 cylation分析由p绞刀，决定?延伸（SHAPE）化学方法，对引物延伸产物进行多重双末端深度测序。这将生成数百万个测序读数，然后基于SHAPE-Seq实验的严格最大似然模型，使用全自动数据分析管道对其进行分析。我们展示了SHAPE-Seq能够准确推断二级和三级结构信息，检测由于单核苷酸点突变而引起的细微构象变化以及同时测量不同RNA分子复杂池的结构的能力。因此，SHAPE-Seq代表了迈向高通量的RNA二级和三级结构研究的强大一步，并且从基础生物学研究到合成生物学系统工程RNA的广泛科学追求，均可获得。

在过去的几年中，非编码但功能性RNA的发现发生了爆炸式增长，这些RNA在维持，调节和捍卫基因组中起着核心作用（1）。同时，基于RNA的机制已成为工程合成生物系统的强大工具（2）。这些天然和合成RNA中有许多具有特定的二级和三级结构，这些功能对其功能至关重要，因此，越来越需要开发能够快速表征复杂RNA群体中结构特征的技术。这种高通量的结构表征测定法将允许快速评估序列对结构和功能的影响，并使RNA工程师能够设计具有所需结构特性的RNA分子文库。

最近已 道了两种用于高通量RNA结构表征的技术：RNA结构的并行分析（PARS）（3）和片段测序（Frag-Seq）（4）。两种技术都结合了经典的体外核酸酶探测技术，这些技术通常一次执行一个RNA，同时对RNA片段进行深度测序，以同时探测从转录组提取的RNA的复杂混合物。尽管第一步很重要，但由于核酸酶探测的固有局限性，这些技术仅提供低分辨率的二级结构信息（5）。

我们已经开发出一种高通量技术SHAPE-Seq，它可以同时测量数百个任意序列RNA分子的定量，单核苷酸分辨率二级和三级结构信息。形状SEQ联合收割机小 择2′- ? ydroxyl 一个 cylation分析由p绞刀，决定? xtension（SHAPE）化学（6）配有一个多路复用分层条形码和深度测序策略，在体外结构探测在一个试管实验（启用并行图.1）。我们还开发了一种最大似然（ML）估计策略，用于推断核苷酸反应性，该策略严格结合了来自同序对照实验的信息（7）。结合生物信息学软件来处理，分类和映射原始序列读取，这将创建一个全自动的数据分析管道。此外，反应性SHAPE是该流水线的输出已经很好地建立，并且可以在现有的RNA折叠算法来确定每个RNA分子（所述结构被立即使用8，9）。

在这项工作中，我们表明SHAPE-Seq能够准确地推断枯草芽孢杆菌 RNase P特异性结构域的模型RNA折叠的二级和三级结构信息。此外，我们显示SHAPE-Seq可以从单个样品中数百个RNase P RNA的条形码副本中推断出此信息。最后，我们使用该技术同时推断由于单点突变而引起的RNase P的局部结构变化，并确定金黄色葡萄球菌质粒pT181转录减毒剂的两个变体的结构，所有这些都在同一混合物中。

结果

SHAPE-Seq管道。

SHAPE-Seq的目标是通过同时对RNA种类的混合物进行SHAPE探测来准确推断核苷酸分辨率的结构信息（图1）。为了明确区分物种，实验中的每个RNA均在其3’端附近用唯一的核苷酸序列进行条形码编码（图S1）。然后在所需的体外条件下混合并折叠这些RNA，这些条件可以包括各种各样的缓冲液（10），配体（11），温度（12）以及常规SHAPE已经建立的其他变量。折叠后，将水池分成两个样本，其中一个（+）用SHAPE试剂处理[此处为1M7（6）]，另一个（-）用对照溶剂处理。然后，这些库通过被1M7修饰（6）阻断的逆转录（RT）过程转换为cDNA ，生成代表1M7修饰（+）位置的不同长度cDNA的条形码分布，或诸如转录酶下降等过程-off引起逆转录（-）的偏向。

（+）和（-）库在RT步骤期间保持分开，以便可以用附加到RT引物5’尾部的附加条形码（称为“手柄” ）进行标记（图1A）。当cDNA库同时作为单个混合物一起测序时，手柄将cDNA片段识别为来自（+）或（-）通道。使用配对末端的Illumina测序（13）进行cDNA的测序。为了将所需的Illumina测序衔接子添加到cDNA产品中，RT引物的尾部包含一个衔接子，另一个通过NaOH水解去除RNA后通过单链DNA连接步骤添加（参见材料和方法）。单链DNA连接步骤是在高温下用热稳定的连接酶进行的，并且在衔接子的3’端具有一个封闭基团，以防止衔接子串联（14）。经过九轮PCR扩增后，文库在Illumina Genome Analyzer IIx平台上以配对末端模式进行测序。每个末端仅需测序50个核苷酸，因为所需的两条信息-SHAPE修饰位置和RNA身份（条形码）-位于cDNA分子的相对末端。这消除了对尺寸选择步骤的需要，该尺寸选择步骤限制了使用其他方法（4）可获得的结构信息。

测序后，根据手柄序列对读段进行分档（图1 B）。Illumina平台在前四个核苷酸掺入中使用随机性来校准光谱重叠和簇识别。因为手柄是序列化的第一个核苷酸，所以我们选择了手柄序列集来表示（+）和（-）读段，（+）的RRRRY（R = A，G; Y = C，T），（-）的YYYR ）。这样可以确保在手柄的每个位置处都对A，T，C和G的相等混合物进行排序。首先通过手柄分离读码，然后通过条形码分离，并使用Bowtie对齐程序包（15）与适当的RNA分子序列进行比对，从而在（+）和（-）通道中创建核苷酸分辨率计数分布。

直接cDNA测序的数字性质允许SHAPE-Seq数据适合严格和全自动的数学分析。在传统的SHAPE实验中，荧光标记的cDNA通常通过毛细管电泳（SHAPE-CE）进行定量，这需要一系列手动数据分析步骤，这些步骤与校正通道迁移率，对齐和将模拟电泳图强度整合为（+）和（- ）分布（16）。减去（+）和（-）分布以得出SHAPE实验的最终输出：每个核苷酸的SHAPE“反应性”代表该位置1M7加合物形成的倾向。先前将SHAPE反应性与NMR阶次参数进行比较的工作表明，反应性与局部空间无序性密切相关，因此是对结构动力学的一种度量（17）。通常，高反应性被解释为平均而言是非结构化的核苷酸，而低反应性被解释为受到规范或非规范，第二或第三级相互作用约束的核苷酸。在减去两个分布之前，通常需要进行两次校正：（+）通道强度通过指数衰减因子进行调整，该指数衰减因子可校正由于单向RT过程在第一个遇到的加合物处停止而导致的片段分布衰减，以及（- ）通道按恒定因子进行缩放，这样当减去两个通道时，非反应位的反应性为零。除了手动之外，

为了克服这一障碍，我们开发了一套严格的自动化数学框架，该框架可用于找到与观察到的（+）和（-）分布最一致的最佳反应性组[请参见材料和方法（7）]。该模型使用ML估计来输出一组反应性Θ和每个引用c的估计平均修改数c。

SHAPE-Seq准确地推断出高度保守的催化RNA的二级和三级结构。

作为SHAPE-Seq平台的初步测试，我们探查了来自枯草芽孢杆菌的高度保守的催化RNA RNase P的特异性结构域，已使用常规SHAPE和毛细管电泳对其进行了广泛表征（6）。此外，通过X射线晶体学测定，RNase P折叠具有高度结构化，具有明确的三级相互作用（18），使其成为该方法初始测试的理想候选者。

图2显示了SHAPE-Seq反应性在RNase P已知结构上的覆盖图。超过750万个测序读数用于计算分子每个核苷酸的Θ值，然后将其转换为常规SHAPE反应性（请参见材料和方法））。如预期的那样，立即可见的是螺旋P8和P9的环中两个高反应性核苷酸区域，因为已知这些环是不成对的。相反，由于广泛的碱基配对，P8和P9茎显示出极低的反应性。在该区域中映射了超过200,000个片段，在（+）和（-）通道之间几乎完美消除，这突出说明即使从大量信息中也获得了较低的反应性。通过比较原始（+）和（-）计数可以看出，这在整个RNase P上都是正确的（图S2）。

形状SEQ与SHAPE-CE的反应性的，用于指示的核糖核酸酶P示出了每一个核苷酸都具有高度的两（R = 0.72）之间的相关性的曲线形状SEQ准确概括外形结构信息（图2 甲，插图）。Pearson的相关R被确定具有和不包含核苷酸G100（星 在图2 甲，插图）。尽管在两种方法中都具有高反应活性，但核苷酸G100在SHAPE-Seq中显示出更高的反应活性。由于它是高度柔性环中的高度柔性核苷酸，因此不会改变这些数据与已知RNase P结构的一致性。因此，它被认为是基于结构解释的异常值。其他两个核苷酸U119和U120显示相似的行为，但程?度较小。这些核苷酸也处于高度柔性的环内，并且根据SHAPE-CE也被表征为高度反应性。尽管在这些位置上SHAPE-Seq和SHAPE-CE之间存在定量差异，但总体结构解释不受所用方法的影响。

应该注意的是，SHAPE-Seq反应谱的几个区域，即核苷酸A130和A194，以及P10.1环，没有SHAPE-CE观察到的反应性。核苷酸A130和A194是单核苷酸凸起，与分子中的其他嘌呤堆叠在一起（图S3）。预期这种相互作用会导致核苷酸柔韧性和对1M7的反应性降低。实际上，这是在SHAPE-Seq中观察到的（反应性约为30％）。这名义上小于使用SHAPE-CE获得的反应性，并且可能是SHAPE-Seq所需的额外规程步骤导致对此类结构效应的敏感性降低的结果。但是重要的是，因为SHAPE-Seq在此区域显示反应性，所以它不会改变RNase P结构的解释。P10.1环是一个稳定的UUCG四环，与RNA中的其他单链区相比，它包含一个稳定的GU摆动，该环会闭合该环并限制这些核苷酸（图S3））。与SHAPE-CE（约20-70％反应性）相比，SHAPE-Seq（约15％反应性）中观察到的反应性较低，不会改变数据的整体解释。尽管在二级结构图上不成对，但已知P12环与P10.1螺旋形成了明确定义的三级相互作用，并且先前已观察到在常规SHAPE-CE实验中没有反应（6）。这在形状SEQ反应性谱（确实观察到图2 甲）。

乙所示形状SEQ数据的叠加到RNA酶P的已知三维晶体结构形状SEQ反应性数据是非常一致的，具有高度反应性的核苷酸映射到的高柔韧性的位置，尤其是未配对的核苷酸是不参与第三级联系（图S3）。这证明了SHAPE-Seq可以推断二级和三级结构信息的功能。

条码编码允许多重结构表征。

SHAPE-Seq的优点之一是能够通过直接测序3’RNA条形码同时从多个RNA中确定结构信息（图1）。为了对此进行测试，我们将WT RNase P RNA的256种不同条形码版本添加到与上述非条形码WT RNase P RNA相同的库中，并进行了SHAPE-Seq流程。条形码由所有四个核苷酸序列组成，并置于SHAPE实验常用的3’结构盒中（图S1）。在体外转录RNA库之前，将这些与简并引物一起引入（请参阅材料和方法）。

映射了超过860万条条形码读取。对于每个条形码，根据SHAPE-Seq数据分析管道（图1）自动计算Θ和c。每个条形码的测序片段总数是不均匀的（从10488到308978），这很可能是由于随机引物合成中的偏差（图S4）。但是，这为我们提供了研究需要映射多少片段以准确重建SHAPE反应性谱的机会。c的分布在0.76的值附近达到峰值，这与WT RNase P SHAPE-Seq数据非常匹配，其中c = 0.73（图S5）。

用两种方法将来自256个条形码分子的反应性Θ与WT RNase P SHAPE-Seq反应性谱进行比较。直接比较SHAPE-Seq的反应性特征谱，我们计算Θ之间的詹森-香农（JS）发散条形码和Θ WT每个条形码（见SI文本）。JS散度考虑到每??个核苷酸的反应性信息，其值在0到1之间。它是具有JS散度= 0的具有相同分布的两个分布之间相似性的对称度量。如图2 C 所示。，每个条形码的JS散度直方图非常紧密地达到峰值，平均JS散度为0.02。作为另一项措施，我们计算了条形码的SHAPE-SeqΘ与WT RNase P之间的Pearson相关系数R。该相关系数衡量两个数据集在一条线上的程度，对于反相关数据，其范围为-1为1表示完全相关的数据。图2C示出了所有条形码的R的直方图，其再次以0.99的平均值紧密地达到峰值。

如图2所示，这两种措施对每个条形码所映射的片段总数的依赖性非常弱。GGGG条形码的最小代表是10,488个总命中，分布在204个核苷酸上，其SHAPE-Seq反应性谱与非条形码RNase P非常相似（R = 0.99，JSD = 0.04）（图S6）。通过除以每个条形码观察到的总片段数，我们估计需要0.1 pmol的RNA上限才能恢复RNase P的SHAPE-Seq反应性谱。这与当前的SHAPE-CE协议相反每个RNA至少3 pmol（19）。就本实验中使用的RNA量而言，每种RNA为0.1 pmol，有可能推断出800多种条形码RNA种类的精确SHAPE-Seq反应性。

SHAPE-Seq解决了由于点突变引起的局部结构变化。

使用条形码，我们能够识别由于任何给定RNA分子中的单点突变而导致的结构变化。作为七个成员的SHAPE-Seq库的一部分，我们从先前的库中生成了天然RNase P分子的五个条形码变体。这些包括WT和以下点突变体：ΔA130，A130U，A131和A194U（表S1）。这些特定的RNase P突变是在RNA中突出的核苷酸处选择的，以提供二级结构的局部细微变化。将SHAPE-Seq管线应用于这种RNA混合物，以确定由于四点突变而导致RNA中130和194位的反应性变化（图3）。与野生型RNase P RNA相比，RNA中几乎所有其他位置均保持不变，并且所有RNA的映射读图数量均相似，范围为1,441,075至1,224,576（图S7）。

130和194位的反应性仅显示了四个突变体中每一个的细微变化，只有几个例外（图3）。）。A130U突变体的反应性在位置130和194均保持不变，表明位置130的U在RNA中保持相似的结构作用，并且不破坏该位置的天然堆积相互作用。ΔA130突变体与预期的位置130的反应性存在差距，并且在位置A194的反应性几乎没有变化。结合RNA维持相似的总体反应模式这一事实表明，去除位置130的堆积相互作用不会对RNA的结构完整性产生很大影响。A131 RNA在位置130处含有两个凸起的A核苷酸，在一个A处的反应性大大提高，而在另一个A处的野生型则非常相似。这表明一个A通过与另一个嘌呤核苷酸堆积而保持与野生型A130位置相似的结构作用，而另一个凸起的A则更加灵活，最有可能不参与与邻近核苷酸的任何约束性相互作用。最终，A194U突变体RNA在位置130处显示出非常相似的反应性，而在位置194处显示出较低的反应性。但是，可以用增强的堆叠或该位置的GU摆动交互来解释（A194U突变RNA在位置130处显示出非常相似的反应性，而在位置194处显示出较低的反应性。但是，可以用增强的堆叠或该位置的GU摆动交互来解释（A194U突变体RNA在位置130处显示出非常相似的反应性，而在位置194处显示出较低的反应性。但是，可以用增强的堆叠或此位置的GU摆动相互作用来解释（图S3），导致核苷酸受到更多限制，因此反应性降低。

使用SHAPE-Seq管线获得的WT RNase P和四个突变体的总体反应性与使用SHAPE-CE方法获得的总体反应性相似（图3）。对突变位点周围反应性谱的更详细检查（图S7）表明SHAPE-Seq和SHAPE-CE的反应性变化遵循相同的总体趋势，但有两个明显的例外。首先，如上所述，SHAPE-CE对130和194位点的突变显示出更高的反应性。其次，在SHAPE-Seq和SHAPE-CE之间的突变位置，RNase P A194U的反应性趋势发生了逆转。尽管在单个位置上两种技术之间存在不一致的地方，但是每种方法对其他位置上的点突变的解释都是相同的。但是，SHAPE-Seq允许在单个试管中进行实验，并进行严格的自动化数学分析。

SHAPE-Seq同时确定复杂的RNA混合物中的结构。

最后，证明我们的能力同时确定无关RNA分子的结构，我们添加了pT181转录衰减器（的两个变体20，21），以含有5 RNA酶p来弥补七构件库形状SEQ库。完整的SHAPE-Seq管线用于生成pT181 RNA两种不同长度的二级结构，它们代表全长衰减子的转录中间体（图4）。从SHAPE-Seq获得的RNA的反应性特征与从对这些RNA的单独探测实验获得的SHAPE-CE反应性极为相似（图S8）。

SHAPE-Seq的反应活性清楚地表明，两个RNA在转录本的5’端折叠成相同的结构，但在3’端折叠成不同的结构。pT181衰减子通过折叠成可阻止或允许RNA聚合酶通过的替代结构来调节转录延伸（20）。这些结构在转录过程中进化，在SHAPE-Seq确定的结构中观察到的变化可能反映了中间共转录折叠状态。这两个结构都与先前的结构探测实验一致（20）。

讨论区

SHAPE-Seq的功能。

SHAPE-Seq旨在结合SHAPE的分辨率和鲁棒性，以及双端深度测序的通量，定量和多路复用功能。因此，SHAPE-Seq对传统的SHAPE-CE进行了一些改进。由于直接cDNA测序的数字特性，我们能够开发出严格的自动化数据分析管道，从而消除了分析SHAPE-CE实验所需的专业知识和用户定义参数的需求（16）。此外，深度测序提供的序列覆盖深度使SHAPE-Seq成为一种更为灵敏的技术，仅需约0.1 pmol的RNA即可准确绘制RNase P的SHAPE反应谱。此特性使SHAPE-Seq特别适用于珍贵的生物仅提供少量起始RNA的样品。

最近，一个对相关核酸酶为基础的高通量RNA结构探测技术被开发（3，4）。尽管他们能够同时探查转录组中RNA的复杂混合物，但总体上总体准确性较差（5）。与这些技术相比，SHAPE-Seq具有几个明显的优势。首先，与庞大的核酸酶蛋白不同，SHAPE实验中使用的小型化学探针可用于从溶液中的RNA 推断二级和三级结构信息。因此，SHAPE-Seq应该能够直接提供急需的信息，以用于根据一级序列预测三级RNA结构的算法的不断发展（22）。此外，SHAPE通常在可变温度和缓冲条件下使用，并不限于酶起作用所需的有限环境。

在测序方面，SHAPE-Seq消除了先前技术中的一个关键问题，该技术要求对整个cDNA进行测序。这些方法对裂解的RNA进行大小选择，该大小会丢弃短片段，这会阻止它们定位RNA分子的某些部分。SHAPE-Seq只需要在cDNA分子的任一端测序少量碱基即可，因此不会受到这种类型的偏倚影响（图S9）。

先前的技术还依赖于RNA混合物的序列差异，将每个片段定位到独特的RNA种类上。由于使用了SHAPE-Seq条形码策略，它能够解决仅单个核苷酸变化的结构后果（图3），从而使其成为一种更为通用的技术。这在使用系统的变异和映射策略来揭示核苷酸的三维方向的实验中尤其有用（23）。

最后，SHAPE-Seq实验的输出是一组反应性，可以将其直接插入现有的RNA结构算法中，以指导RNA的计算折叠（9）。我们发现以这种方式使用的SHAPE-Seq反应性能够概括本研究中使用的两个pT181衰减器长度变异体的结构（图4）。由于这两个结构代表了在衰减子转录过程中可能的折叠中间体，因此SHAPE-Seq可用于通过同时探测中间长度的RNA（每个都有自己的条形码）来概括RNA共转录折叠途径。

我们注意到，尽管来自SHAPE-Seq的数据与来自SHAPE-CE的数据极为相似，但还是有所不同。这些可能是由于SHAPE-Seq协议中需要执行多个额外步骤，包括适配器连接，PCR和任何Illumina Seq方法所需的簇形成/测序步骤。即使这样，使用内置（-）控件，数学框架仍可以准确地恢复Θ值，在某些情况下，该值似乎比从SHAPE-CE获得的Θ值更准确（请参见图S8）。

扩展SHAPE-Seq。

SHAPE-Seq在RNA混合物混合物上同时推断结构信息的能力可以通过强大的方式得到扩展。尽管发现这项工作中的RNA不相互作用，但该技术可以扩展到有意研究由特定RNA-RNA或RNA-蛋白质相互作用产生的结构变化。这可以通过在RNA混合物上执行SHAPE-Seq来完成，该混合物带有或不带有预计会与混合物相互作用的蛋白质或RNA。然后可以将数据进行比较，以发现核苷酸柔韧性的变化，该变化是由于直接与RNA结合或间接构象变化或两者引起的。除了比SHAPE-CE高得多的吞吐量外，SHAPE-Seq还提供了更详细的信息，与传统的天然凝胶电泳或用于检查RNA-RNA和RNA-蛋白质相互作用的过滤器分配方法相比，这些相互作用的分辨率更高。在存在或不存在配体的情况下，可以使用类似的策略来探测RNA池，以进行快速，一步的SELEX RNA适体。

同样重要的是，SHAPE-Seq大大受益于SHAPE已经进行的许多扩展。特别是，作用较快的SHAPE试剂（例如BzCN）可以与多路复用一起使用，以探测RNA折叠途径（10）。该协议也可直接用于映射其他依赖结构的探针的修饰（23）。此外，SHAPE-Seq将直接受益于深度测序技术的改进，这将使这些实验对个别研究人员而言更加实用。

因此，SHAPE-Seq代表了使RNA二级和三级结构的研究具有高通量且可进行从基础生物学研究到工程RNA合成生物学系统的广泛科学追求的强大步骤。

材料和方法

结构选择性RNA修饰。

如先前所述，所有RNA均通过标准的体外合成方法进行了合成，并经1M7（6.5 mM，最终）修饰，并稍作修改即可用于深度测序分析（6）。有关详细信息，请参见SI Text。

通过毛细管电泳进行形状分析。

引物延伸和数据分析的一般程序是参考文献。 24。

深度测序的SHAPE分析。

按照其他地方（24）所述的引物延伸方案，使用带有Illumina A_adapter_t和（+）或（-）柄的尾部的RT引物（参见SI Text），按照第一引物延伸方案进行了第一链cDNA合成程序。引物延伸后，将RNA水解，并使用ssDNA连接酶（circLigase，Epicentre）将Illumina A_adapter b连接至每个cDNA。使用Agencourt Ampure XP珠去除了多余的A_adapter_b。最后，进行9或12个PCR扩增循环（13个），没有帖子的尺寸选择步骤。使用高灵敏度的DNA芯片在Agilent Bioanalyzer 2100上对文库进行质量分析，然后在Illumina Genome Analyzer IIx上对每个配对末端读数进行50个循环测序。可根据要求提供数据。有关详细协议，请参见SI Text。

条码测序读段的生物信息学分析。

首先通过检查从实验中探测到的每个RNA的3’端产生的读数的5’端的4核苷酸操纵序列，将RT片段的读数首先分为1M7处理和未处理的库。然后从每个读数中修剪该手柄，以使读数与所探测的RNA对齐。然后使用FASTX工具包[
http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ] 修剪A_adapter_b和A_adapter_t的读取（请参见SI Text）。使用Bowtie 0.12.8（15）将配对的读数与所探测的RNA最佳比对，以确定RT终止计数。然后将这些RT停止计数用于计算基于ML的反应性。有关详细信息，请参见SI文本。

通过最大似然估计处理SHAPE-Seq数据。

通过反应性参数化的SHAPE-Seq随机模型Θ，每个分子的预期修饰数c和自然聚合酶下降速率Γ用于通过最大似然估计来推断感兴趣的量（7）。我们假设每个RNA的修饰数是Poisson分布的，未知参数c待估计。使用此模型，可以通过以下公式计算实验中获得的一组片段计数X（+）通道和（-）通道Y的可能性：

其中X k，Y k是到达RNA中第k位的片段数。参考文献中提供了模型推导和分析的详细信息。 7。

在Θ和反应性之间转换。

在需要的地方，通过排除最高2％的活性物并将其标准化为下一个8％的平均值，将Θ转化为SHAPE反应性（9）。在需要的地方，通过除以反应活性之和，将SHAPE-CE反应活性转换为Θ，以使Θ之和等于1。在未对SHAPE-CE数据进行指数衰减校正的情况下（16）使用ML校正（7）计算θ 。

使用SHAPE-Seq反应性约束进行二级结构预测。

按照标准程序（9），在RNA结构程序中将SHAPE反应性转化为伪自由能变化项。有关详细信息，请参见SI文本。