【实验技术笔记】细胞表型检测之细胞增殖（CCK-8法 + BrdU掺入法 + 平板克隆）

1. 细胞增殖的定义

(2) CCK-8 测细胞增殖操作流程

★ 预实验：做几个孔，摸索接种细胞的数量 和 加入 CCK-8 试剂后的培养时间。

接种细胞数量：CCK-8 至少要测 5 天，因此接种的细胞量要保证长到第五天时，细胞不能长得太满。
培养时间：根据细胞种类不同、每孔细胞数量多少来定。如，白细胞难显色，因此要培养时间较长或要增加细胞数量；悬浮细胞相对于贴壁细胞更难显色，加入 CCK-8 1-4h 后用肉眼看下显色程度，或用酶标仪检测，如果显色困难，就将培养板再放回培养箱继续培养数小时；贴壁细胞培养 30min 就可以取出来看显色程度。CCK-8 最佳反应时间是以具体显色的最佳时间为准。

★ 正式实验：
① 制备细胞悬液铺 96 孔板。

贴壁细胞要消化充分（可以稍过一点点），这样不需要用力吹打就可以让细胞分散得很好；如果消化不完全，就要用枪用力吹打，使细胞受到机械损伤，影响实验结果。
消化后要做细胞计数，调整到合适的密度（预实验摸索到的细胞接种量）。
铺 96 孔板：
△ 要铺均匀，先在每孔中加 50ul 完全培养基（可以在孔中形成液体的表面张力，使后面接种的细胞分散开），再向各孔加 50ul 细胞悬液。这里相当于把细胞稀释了 1 倍，因此前面调整细胞密度时要把细胞密度加倍。
△ 铺板时注意不时地混匀细胞悬液，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔就混匀一下，保持细胞悬液随时都是均匀状态，尽量保证加到每个孔中的细胞数量都是一致的。
△ 96 孔板周围一圈孔不加细胞，而是加满 PBS，因为周围孔在培养箱中持续培养的过程中容易蒸发，不适合铺细胞，加 PBS 可以保护被围在中间的孔。
△ 铺完板后，轻敲板底或用振荡器摇板，帮助细胞分散。

② 37℃培养箱中培养。 转移 96 孔板时，注意尽量端平端稳，一般状态好的细胞 2h 就能贴壁。

③ 加 CCK-8 试剂 10μl/well。细胞贴壁后，加 CCK-8 采集 0 点的数据。

使用新鲜的完全培养基稀释 CCK-8（），完全混匀，把带测控中旧的培养基吸出，每孔加入 100-110ul 新配好的含 CCK-8 的培养基（保证每孔加样量一致即可，这样做可以避免直接加 10ul CCK-8 引起的加样误差）。
加液时，注意沿着孔壁慢慢加，尽量避免出现气泡（影响酶标仪读数），如果有气泡也不用着急，可能再培养之后气泡就消失了。
配 CCK-8 时，多配 1-2 份（看做了多少板）含 CCK-8 的培养基，加入同一块板的空孔作为调零孔（如果细胞培养时含药物，调零孔也要加药物，只是不加细胞）；如果一次测多块板，每块板都要加调零孔。

④ 继续培养数小时（具体时间是预实验摸索好的）。肉眼看到培养基变成橙色，培养时间越长，橙色越深。

⑤ 测定 450nm 处 OD 值。

培养到合适时间，上酶标仪检测 OD 值，OD 值控制在 0.2-1，1 左右较好。
建议用双波长检测，检测波长 450nm、参比波长 600-650nm 两个波长各检测一遍，参比波长可以过滤掉因为液体浑浊、孔板底不干净带来的测量误差。

周围一圈加满无菌 PBS，中间粉色区域铺细胞
分三组，每组至少 3 个复孔：
◆ 空白对照：不做任何处理的细胞
◆ 阴性对照：如，转染了对照质粒的细胞
◆ 实验组：如，转染了过表达质粒的细胞
中间最后一列留作调零孔，从上到下刚好 6 个孔，测 5 天，每天一个孔。
酶标仪测 OD 值时，要取下 96 孔板的盖子，迅速测完，细胞不会污染。
也可以提前规划好，把同一个时间点的细胞铺在同一块板上，测一块丢一块。

(4) CCK-8 数据处理与绘图

例如：检测波长 450nm，参比波长 600nm。

第一步：x = OD450nm－OD600nm。（计算每孔的△OD，调零孔也要计算）
第二步：y = x – △OD_调零孔。每孔的△OD 减去调零孔的△OD，如果所用的仪器可以自动调零，跳过这一步计算。
第三步：复孔求平均值。
第四步：将独立重复 3 次的数据导入 graphpad prizm 画折线图。
如果需要测定细胞的具体数量（想知道细胞每天涨了多少个），需要建一个标准曲线。
细胞计数 → 等比稀释细胞，建立 5-8 个梯度，3 复孔/梯度 → 37℃培养箱中培养 → 加 CCK-8 试剂继续培养细胞 → 测定 OD 值 → 制作标曲，x 轴为细胞数量，y 轴为 OD 值。

细胞周期

BrdU 掺入法测细胞增殖操作流程

数据处理与绘图

（1）拍照

拍照时，每张片子随机拍摄 3 个视野，放大倍数以方便细胞计数为宜，比如。
DAPI 染色（染细胞核，代表总细胞数）和 BrdU 染色（染正在增殖的细胞）的照片都要拍，同时注意保存 DAPI 和 BrdU merge 的照片。

（2）数据处理

● 细胞计数的方法：
【ImageJ 图像处理】6. 自动细胞计数

数据处理与绘图

拍照时，使用（带白光模式，底部带补光板的）成像仪或相机拍摄整个皿。
将平皿倒置，用带格的透明胶片叠在培养皿上（或者用记笔在培养皿盖上画格，盖子翻过来，把皿叠在盖子上，主要是防止漏计数），肉眼计数（先用低倍镜观察大于 50 个细胞的克隆用肉眼看大致有多大，再用肉眼计数），或在低倍镜下计数大于 50 个细胞的克隆数，或者拍照后用软件计数。
计算公式：克隆形成率= $克隆数接种细胞数 frac {克隆数} {接种细胞数}$ ×100%
将 3 次独立重复的数据都分析完后进行统计分析并绘制柱状图。

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