蛋白桑：采前钙锌处理、采后SNP、1MCP处理对桑叶采后生理的影响

摘要 本试验以麒麟饲料桑为试验材料，研究采前CaCl2处理和采前ZnCI：处理、硝普钠 (SNP)，硝普钠与NADPH氧化酶抑制剂联合处理(DMTU)、水杨酸(sA)处理、1-MCP处理、 对采前处理的叶片进行采后1-MCP处理对桑叶采后生理的影响。 采前CaCl2和ZnCl2处理对采后生理的影响表明：ZnCl2处理和CaCl2处理的呼吸峰和乙烯 峰的出现时间并没有推迟；但ZnCl2处理的叶片呼吸速率低于对照。ZnCl2处理的叶片POD、 APX活性高于其它两组。CaCl2处理的叶片在第5天，第7天时APX活性显著低于对照，叶绿 素含量明显高于对照。 未处理叶片采后l-MCP处理对采后生理的影响表明：1-MCP0．5ul／L处理的叶片在前5天 叶绿裹含量高于对照。1-MCP0．5ul／L处理和1-MCPl．0ul／L处理的乙烯释放量低于对照。 性高于其它两组。 采前CaCl2处理的叶片经过采后1-MCP处理的结果表明：采前CaCl2处理采后1． MCP0．5ul／L处理的叶片叶绿素含量、可溶性蛋白含量明显高于对照。采前CaCl2处理采后1． MCPl．0ul／L处理的叶片呼吸锋推迟两天出现，并且CAT、APX活性和MDA含量明显低于对 照。采前ZnCl2处理采后I-MCPI．ouI，L处理的叶片叶绿索含量明显高于对照。呼吸峰也推迟 两天出现，CAT、APX活性明显低于对照；但MDA含量高于对照。 SNP处理对于采后生理的影响表明：$N1)O．5mM处理的叶片贮藏时间为15天，比对照多 4天。三个浓度处理的叶片呼吸峰在出现时间不同。SNP0．5mM处理的CAT活性小于其它三 组处理，MDA含量显著低于对照。 NADPH氧化酶抑制剂处理联合SNP处理对于采后生理的影响表明：DMTU0．5mM处理 的贮藏时间为13天，比对照多两天。DMTU：．三个浓度处理的呼吸峰到来的时间不同。三个 浓度处理的可溶性蛋白高于对照，而MDA含量低于对照组。 比较水杨酸处理、SNP处理、NADFH氧化酶抑制荆处理联合SNP处理：SAl．0mM处理 的呼吸峰值高于其它处理组，出现的时间晚于对照两天。SNPo．5mM处理蛋白含量高于其它 处理，MDA含量最小。三组的叶绿素含量变化相差不大。

第一章绪论 1．1研究目的及意义 1．1．1桑叶的营养价值 alba 桑叶始载于《神农本草经》，为桑科植物桑^如rw L的干燥叶，味苦、甘，性寒，归 肺、肝经：功能疏散风热、清肺润燥、清肝明目；主治风热感冒、头昏头痛、目赤昏花等 症。后代中医药书籍中有桑叶治疗消褐病的记载，如《本草纲目》记载：桑叶“煎汁代茗． 能止消渴”，“炙熟煎饮，代茶止渴”。近代医家也常将桑叶用于治疗糖尿病且得到了满 意的疗效。现代药理研究证实桑叶可抑制血糖的升高，可预防和治疗糖尿病吐 桑叶中有很 多成分如黄酮、生物碱、多糖、氮基酸、维生素和微量元素等‘“，其中黄酮、多糖、生物碱 是主要活性成分。具体如下： 黄酮及黄酮苷类：含有芸香苷、槲皮素、异槲皮苷、槲皮素．3．三葡糖苷等化台物。 甾类成分；舍p-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、p谷甾醇p-D-葡糖苷、蚊麻脂醇、内消旋 肌酵、昆虫变态激素牛膝甾酮和蜕皮甾酮口月。 挥发油成分：含有乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸、异己酸、水杨 酸甲酯、愈创木酚、酚、邻苯甲酚、间苯甲酚、丁香油酚等，还含草酸、延胡索酸、酒石 酸、柠檬酸、琥珀酸、棕榈酸、棕榈酸乙酯、三十一烷、羟基香豆精‘31”。 糖类：含有蔗糖、果糖、葡萄糖。 氨基酸类：含有天门冬氨酸和谷氨酸等17种氨基酸。降血压物质P氨基丁酸含量高达 226mg／1009，令人注目，而T一氨基丁酸由谷氨酸转化而来，桑叶中谷氨酸高达2323 mg／lOOgI”。 维生素类：含有维生素A、维生素Bl、维生桑B2、烟酸、维生素C、视黄醇 (retin01)、胡萝h素及食物纤维等口棚。 微量元素：含有锌、铜、硼、锰、铁等多种微量元素p,41。 生物碱成分：Asano等早在1994年就从桑叶中分离出6种生物碱，并确定了其结构旧。 Kimura等观察了以上6种生物碱对SIz引起的糖尿病小鼠降糖作用，实验结果表明．N-Me 物中唯独桑叶含有，它是一种糖苷酶的抑制剂。 另外，种植桑树可以额外收获桑葚和桑叶作为食品(如欧洲南部，印度)。桑树可分为三 种：白桑(MornsalbaL．)，黑桑0订oms mbra uigraL．)和红桑(MomsL．)。自桑发源于西亚，红 桑发源于北美和南美，黑桑发源于俄罗斯南部口】。

1．1．2桑在我国的品种和分布 在中国，桑又名家桑、荆桑、桑椹树、黄桑。落叶乔木，高3～7m或更高，通常灌木 状，植物体舍乳液。树皮黄褐色，枝灰白色或灰黄色，细长疏生，嫩时稍有柔毛。叶互 生；卵形或椭圆形，长5～10cm，晟长可达20cm，宽5～1Icm，先端锐尖，基部心脏形或不 对称，边缘有不整齐的粗锯齿或圆齿；叶柄长1．5～4cm：托叶披针形，早落。花单性，雌 雄异株；花黄绿色，与叶同时开放；雄花成穗状花序；萼片4裂；雄花有雄蕊4；雌花无花 柱，柱头2裂，向外卷。聚合果腋生，肉质。有柄，椭圆形，长l～25cm，深紫色或黑 色，少有白色。花期4～5月。果期6～7月pJ。 我国有丰富的桑树资源，分布于全国各省区，主要有珠江流域广东桑类型、太湖流域 湖桑类型、四Ⅲ盆地嘉定桑类型、长扛中游摘桑类型、黄河下游鲁桑类型、黄土高原格鲁 桑类型、新疆白桑类型和东北辽桑类型，总面积达7593．67hm2[91。

1．1．4研究目的和意义 桑叶有如此多的营养功能启发人们对其食用价值进行进一步的开发。而鲜桑叶和其他 叶菜类植物一样。采后容易失水，失绿，保鲜期短。因此研究桑叶采后生理特性对于桑叶 的贮藏有着积极作用。

1．2国内外研究现状 1．2．1国外叶菜采后生理研究现状 叶菜类的采后会出现霉变，失绿，失水，褐变等。发生这些变化的原因主要是叶片不 能再丛植株中吸取养分Il”．叶片容易衰老。而使叶片衰老的之间原因是细胞程序性死亡 ”…。在桑叶采后生理研究方面的论文很少。但是在叶菜类采后保鲜、延缓衰老方面的研究 已经取得一些成果。用必须脂肪酸减少叶菜中(卷心菜，生菜，菠菜)POD的活性，从而保 持蔬菜品质。用到的必须脂肪酸有：桉树油．茶树油，蜂蜜， 迷迭香油，丁香油和柠檬油 和~ⅡcI“，采用OPP-Coex-film包装防止胡萝^果胶的损失。但不可以用于生菜使果胶的损 失增加。 叶菜的品质由主观因素和客观因索决定。

1．2．2采后受采蔚因素的影响 环境因素，营养因素，生理因素和基因田1是影响采后品质的主要采前因素。营养因素 是影响采后果蔬品质的主要因素，氮、磷、钾，尤其是钙元素被 道影响采后品质。钙 可加固植物的细胞壁。用ca处理过的苹果在贮藏期间的品质远远好于对照。采前Ca处 理可以有效延迟水果软化IⅫ。 在桑叶叶片中ca含量的增加与叶片的成熟度和ca的渗入液泡 的能力有着密切关系127J。外源Ca处理可抑制己烯产生，使呼吸紊乱。 植物主动吸收锌离子，参与叶片的光合作用。锌影响氮的代谢，影响一些酶的合成， CAT(catalytic．过氧化氢酶)【缺zn对植物的生长不利，同时高浓度的zn对植物有毒副作 用】。适量的zn帮助Zn合成的蛋自质和功能性氮基酸免于氧化伤害。

1．2．3No在叶菜_及花卉保鲜方面的应用 Nitricoxide(N研是植物和动物体内的信 物质，影响生长发育。NO产生的途径有两 种。一种是硝化反应，通过氨的固定或呼吸作用【另一种是N02通过光介导类胡萝h索的 非酶途径‘34]和NADPH硝酸还原酶的酶催化途径产生口”。NO首先在1996年被定性‘蚓，随后 调查发现与一系列生理过程有关，包括内源乙烯和叶压的调控‘”，水分流失‘”】，植物免疫 ，花色素生物合成和叶绿素产生【根的生长、果实、花的发育】。NO近期被用于延长 货架期。采后NO的熏蒸可以有效延长蔬菜、花、果实的货架期，比如，草莓以及康乃 馨。 123．1NO延长货架期的作用原理 一种推测是抑制了乙烯的作用‘“。植物内源一氧化氮可以通过抑制乙烯的生物合成和 调控环化核苷酸在植物组织中的水平．来延缓植物组织的成熟和衰老，延长果蔬等组织的货架 期‘删。 123．2NO的供体 SNP(sodiumnitropmsside，硝普钠)。当然有文献中 道直接使用No气体作为供体‘蚪】。

1．2．41一McP在果蔬保鲜方面的应用 广泛应用于延长园艺产品的货架期和增强品质方面‘剐。I-MCP不光在商业上带来效益，在 科研方面对乙烯的研究提供了新的角度‘5”。1-MCP处理可以显著延长芒果、苹果、香蕉、 梨、柑橘、杏、李、草莓、胡萝h、生菜、康乃馨、蝽果蔬和花卉的货架期。

1．2．4．1 1-MCP作用原理 合乙烯受体，并与乙烯受体结合后呈不可逆，因而可以从受体水平上阻断乙烯信 转导， 阻止内源和外源乙烯发生作用。但使用1-MCP颁在合适的浓度、时问和温度下【”，只有如 此才能更好的与乙烯受体结合。

1．2．4．2 1-MCP豹使用对于果蔬的影响 1．24．2．1I-MCP使用的浓度 苹果需要的最低浓度1日I．，I，才能抑制乙烯发挥效用‘”。康乃馨需要的最低浓度为 2．Snl／L。浓度介于lmL几【和12InL几可以抑制生菜中乙烯的作用吲。在西红柿中，浓度为 7rd／L可以延迟番茄从绿色到红色的转变8‖”。稍高一点浓度的l—McP(o．1．100mI。n．)处理2h 对绿色番茄起作用，20ⅡlL，L可延长完熟番茄的货架期””。1-MCP浓度5nl／L和50nl／L对于未 成熟的香蕉没有作用，500rI儿可以推迟成熟‘鲐l。而S瑚er等四人 道的有效浓度为0．7nl／L。

1．2．422使用的温度 现有的 道中，1-MCP的使用温度在20—250C。更低的使用温度一般与浓度和时间有 sativum)$J” 关。低温时l—MCP对于一些作物不起作用。温度在(5-100c)时，芜葵(Conandmm 乙烯不敏感。

1.2．42．3使用的时问 不同的作物1一MCP使用的时期和作用的时间不同；越是易腐烂的作物，使用的时期越 早。比如生菜和pakchoy(Brassicarapa)m1。而另一部分水果，比如成熟的杏和李需要在贮 藏后使用I-MCP，可以更有效地抑制乙烯的产生、水果的软化和永久褐变唧。还有一部分 水果在贮藏前后分别傲两次处理可以更好的。

1．3主要研究内容 1．3．1技术路线 利用1-MCP、NO延长货架期及其机理。外源NO处理影响sOD，CAT。APX等酶活、 叶绿索等的作用。因为光可以通过NADPH硝化还原酶产生NO，所以我们用了NADPH氧化 一致， 以同一时间采摘同品种相同成熟度桑叶为材料，采叶标准为以雀口期芽为桑芽，从顶 芽向下数，第一片开叶为1叶，采摘7～8叶。 由于采前营养因素对于采后产生深远影响，所以对采前桑叶进行CaCl2和ZnCl2叟t理。 专门划定桑园区域进行采前处理，避免对其它桑树造成影响。对采前处理的叶片进行四次 CaCl2和ZnCl2唢洒，使其吸收充分。

1．3．2研究内容 本试验以麒麟饲料桑为试验材料，研究采前CaCl2处理和采前ZnCl2处理、硝普钠 (SNP)， 对采前处理的叶片进行采后1-MCP处理对桑叶采后生理的影响。

第二章材料与方法

2．1．材料 桑叶品种为麒麟饲料桑。供实验使用的桑树位于北京市大兴区桑叶园。采集时，以同 一时间采摘同品种相同成熟度桑叶为材料，采叶标准为以雀口期芽为桑芽，从项芽向下数． 第一片开叶为1叶，取第7、第8片无腐烂、无虫食的叶片作为研究材料。

2．2．处理方法 2．2．1 采前处理 单独使用浓度为0，2％的CaCl2喷洒20株桑树植株，每7d喷洒一次，喷洒4次。间隔几 株，单独使用浓度为0．2％的ZnCl2喷洒20株桑树植株，每7d喷洒一次，喷洒4次。喷洒日期 为717，7．24，7．31，8．7。8．14日采集叶片。同时采集未做处理的叶片作为对照。 2．2．2 1-MCP处理 uI／L，1 出。处理在室温(20±10c)、自然光照条件下进行。将桑叶分别置于含有0．5p忱的1． 密闭帐中12h，之后以同种方法贮藏作为对照。

2．2．3NO供体SNP处理 分别将未做任何采前处理的叶片浸泡于浓度为0．1mM、0．5mM、1．0mM的SNP溶液中， 进行真空1-o．04MPa)渗透，持续时间为2min。以水处理作为对照l，以浓度为0．1mM、 O．5mM、1,0mM的SA处理作为对照。

2．2．4SNP与NADPH氧化酶抑制剂联台处理(DMTU处理) 分别将未做任何采前处理的叶片浸泡于浓度为0．1mM、O．5mM、10mM NADPH氧化 7 2rain。之后取出。30rain后，分别将叶片浸泡于应对的相同浓度的SNP溶液中，同种条件处 理。以水处理作为阴性对照，以浓度为0．ImM、o．5mM、1．0mM的sA处理作为阳性对照。

2．3．取样 将桑叶保藏手室温20。(2下，相对湿度90％-95％下贮藏。将叶片的优劣等级根据其表观 质量GeneralAppcarance(GA)划分等级。最好的状态为9，最差的为l。当叶片质量小于55时 为不可食用状态。决定GA的因素是叶片的失绿程度和失水程度。将失绿程度分为6个等 级，l为完全失绿变为黄叶，6没有黄色特征。失水程度划分为0(最差)-4(最好)个等级 当GA达到8，5，7，5，6，5．5，4．5分别取样。测量呼吸速率和乙烯C：l-h释放量之后将样 品用液氮速冻，在-200c下保藏。

2．4． 理化成分的测定 2．4．1，乙烯与呼吸速率的测定 将3．4片桑叶置于lL干燥器中0．5h后取ImL气体，测定C02含量：l5h后，取lmL气体用 于铡定果实乙烯释放量。用日本岛津GC-9A型气相色谱仪裣潮乙烯释放量，色谱条件：柱 流速50raL／rain。助燃气空气375mI．Jmin，柱温50℃，检测室温度120″C。重复3次。 乙烯释放量(pl·g-I·h-1产待测样品释放的乙烯浓度×干燥皿体积，(样品重量x密闭时间)

2．4，2．酶液提取方法 1M磷酸缓冲液；1％PVP)冰浴研磨 称取19叶片样品，用5nIL样品提取液含(pH7．0，0 匀浆，12000Xg(4℃)冷冻离。t’,,20min。上清液用于酶活测定。

2．4．3．SOD活性测定 采用NBT法f621，酶反应液：O．1M pH7．8的磷酸缓冲液含(13n洲蛋氨酸，759MNBT， 4¨M核黄素和100nM 抑制NBT光还原50％为一个活性单位(U)。 8 U=12(s-a)／qo一曲]xn／W S．样品照光后的吸光值 A·未加酶液的反应液照光后的吸光值 b-未加酶液的反应液照光前的吸光值 m稀释倍数 W-样品重量(g)

2．4．4．CAT活性测定 参照斯使用的方法‘6”，略有改动。3mL反应体系含(pH7．0，0．1M磷酸缓冲液，lmM u H202)，加,N30 L酶液，测定在lmin内240nm波长下吸光值的变化。酶括性以mM H202·g-1FW·min”1表示。

2．4．5．APX活性测定 参照Jos亡使ffJ的方法呻，略有改动。3Ⅱ1L反应体系含(pH7．0，O．1M磷酸缓冲液， 0．5mM抗坏血酸和0．1mM 化。酶活性以Ⅲ1．g-1FW·min-1表示。

2．4．6．POD活性的测定 酚和0．1m／vl ix H202)，NA30L酶液，测定在IrainI勾470nm波长下吸光值的变化。酶括性以 U计。

2．4．7．M DA含量测定 MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法‘6唧，取O l札提取液加入0．6mLlO％三氯乙酸内 含0 别测定532nm和600nm处的消光值。计算公式如下： 9 式中 V一提取液体积(mL) Vl一反应体系体积(mL) v2一测定用提取液体积(mL) W一样品重量(g)

2．4．8．可溶性蛋白含量的测定 以牛血清白蛋自制作标准曲线‘6”。取30ul的提取液，加入考马斯亮蓝G250溶液 (100rag考马斯亮蒋G-250溶于5ml90％的乙醇溶液中，加入85％的正磷酸，定容到lL)Snfl， 混匀反应5min后，测定在595nm处下的吸光度。依照下式计算样品中可溶性蛋白的含量。 可溶性蛋白含量(雌·g-1)=从标准曲线查到的蛋白含量x提取液总体积棚9定用的样品体 积x样品重量 。

2．4．9．叶绿素含量的测定 参照Tbdd使用的方法(嘏】，略有改动。秤取O 59叶片，用液氮将其研磨成粉末，用5IIIL 将两次取得的上清液混匀，稀释7倍。 把叶绿体色素提取液倒入光径Icm的比色杯内。以80％丙酮为空白，在波长665nm、 者之和为总叶绿素的浓度。 叶绿素的含量(rag·g-1)=【叶绿索的浓度x提取液体积×稀释倍数1，样品鲜重。

2．5． 数据的统计和分析 每个样品做至少三次重复。采用Excel软件对检测数据进行统计分析与制图。

2．6．试验设备及主要仪器 高速台式冷冻离心机20G(上海安亭科学仪器厂) UVIKON XL型多功能紫外分光光度计(SECOMAM公司) -80℃超低温冰箱!vcO(美国) GC-gA型气相色谱仪(日本岛津) RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂) SHZ．III型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂) 恒温水浴锅(北京靖卫科学仪器厂) 第三章结果与分析 3_1采前CaCl2j}I：IZnCI：处理对桑叶采后生理的影响 3．1_l叶绿紊含量的变化 如图

3．1，贮藏的前5d，叶绿素损失的速度较慢。经过采前处理的两种叶片的叶绿素含 量在第一天低于对照，CaCl2处理的低于对照18．6％。从第5到第7天，三组处理的叶绿素损 失速度加快。从第7到第9天，CaCl2处理和对照继续下降，而znCl2处理的叶绿素含量增加。 24 22 2O l8 l5 l4 12 ^麦t_囊．臼E。芒暑c8盎暑420-6 1O i 3 5 7 9 Time“J BB3-1 采前CaCI：或ZnCI：处理对姗羹叶采后叶绿素含量的影响 of on andof leaves Effect handling qilin Fig．3-1 pre-CaCImZnCIi chloroahY¨contentmulberry the 120±1)”CandRH95％v duringstorage 圈上的上下竖缱为±标准误羞鼓(以下圈中相而 3．12可溶性蛋白含量的变化 如图

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