蛋白桑：桑黄菌丝体多糖的提取及其抗氧化活性研究

桑黄是自然界中十分珍稀的药用真菌,多糖是其中主要药效成分。桑黄多糖具有良好的抗肿瘤、提高肌体免役能力等作用，动物实验证实桑黄多糖是通过增强机体免疫力而达到抗肿瘤作用。

桑黄属于担子菌亚门( Basidiomycotina) .层菌纲( Hymenomycees)、非褶菌目( Polporaceae)、锈革孔菌科( Hymenochaetaceae) . 木层孔菌属( Phellinus) ;按种分主要有裂蹄针层孔菌Phellinm linteus, 火木层孔菌Phellinus igniarius 和鲍氏层孔菌Phellinus baumiiPilai-4)。P.linteus 主要分布于韩国,而P.igniaris和P.baumi主要分布于我国国内。

1材料与方法

1.1 材料与仪器

桑黄菌( Phellinus igriarius ,菌株编 5.0095)中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。以PDB培养基液体种子培养,发酵培养基由小麦粉51.6 g/L、 麸皮13.8 g/L、 桑枝粉10 g/L. KH,PO.1 g/L、MgSO, .7H,O0.5 g/L组成,自然pH。将种子液接至发酵培养液中，接种量为10%.装瓶量100 mL/250 mL;于28 C转速135 r/min摇床中培养5 d,收集菌丝体,清洗、冻干。

氯化硝基四氮唑(NBT)南 京生兴生物技术公司;吩嗪甲酯硫酸盐( PMS )、还原型辅酶( NADH) Sigma公司;考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白、无水乙醇、葡萄糖、浓硫酸、苯酚碘.碘化钾、a-萘酚、酒石酸钠钾均为AR级.上海 国药集团;水为二次蒸馏水。

H1850R高速冷冻离心机湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;ALPHA2-4冷冻干燥机德国.CHRIST; Varian Cary 100紫外分光光度计美国VARIAN ;NEXUS傅立叶红外分光光度计美 国热电尼高力。

1.2.2桑黄多糖得率计算

采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准品,测定总糖含量”;采用考马斯亮蓝法,以牛血清白蛋白为标准品,测定蛋白质含量。

1.2.3桑黄多 糖提取单因素实验

1.2.3.1提取时间

准确称取桑黄菌丝粉各0.5 g,按料液比1:20( g/mL)加入蒸馏水，于100 C水浴分别提取0.5. 1.0、1.5.2.0.2.5 h, 过滤，滤液定容至250 mL,测定总糖含量、计算得率。

1.2.3.2提取温度的选择

准确称取五份桑黄菌丝粉各0.5 g,按料液比1:20(g/mL) 加人燕馏水，分别在60.70.80 .90 ,100 C水浴中提取2.0 h,过滤,提取液定容至250 mL,测定总糖含量、计算得率。

1.2.3.3提取料液 比的选择

精密称取五份桑黄菌丝粉各0.5 g.于100 C条件下，分别按照1:5.1:10.1:15、1:20、1:25( g/mL)的料液比提取2.0 h,过滤,滤液定容至250 mL,测定总糖含量、计算得率。

1.2.3.4提取次数的选择

精密称取五份桑黄菌丝粉各0.5 g,按料液比为1:15(g/mL)加人蒸馏水,于100 C下提取2.0 h、分别提取1.2.3.4.5次,合并滤液浓缩,定容至250 mL,测定总糖含量.计算得率。

1.2.3.5桑黄水提取液总糖得率计算

水提取物总糖得率(%) =总糖含量x稀释体积/样品干质量x 100。

1.2.4桑黄菌丝体多糖提取的正交实验设计在单因素实验的基础上,采用三因素三水平,按L。(3′)正交设计进行桑黄菌丝体多糖热水提取正交实验，以总糖得率作为响应值,各因素水平如表1所示,每组实验均重复3次。

1.2.5桑黄菌丝体多糖基本理化性质分析

1.2.5.1桑黄多糖的化学性质验证

观察桑黄菌丝体多糖的外观及在水和有机溶剂中溶解性,与碘-碘化钾反应.(-萘酚反应和斐林试剂反应，参照文献进行。

1.2.5.2紫外光谱检测

将浓度为 1 mg/mL的桑黄菌丝体多糖溶液稀释一定倍数后，在190-400 nm扫描。

1.2.5.3红外光谱检测

5mg桑黄多糖冻干样品..KBr压片后,在400-4000cm-的中红外区扫描。

1.2.6桑黄菌丝体多糖体外抗氧化活性

1.2.6.1清除超氧负离 子的测定

将桑黄菌丝体多糖用Tris- HCI缓冲液( pH8.0, 16 mmol/L)溶解,制成不同浓度的样品溶液。NBT。NADH均用Tris-HCI缓冲液( pH8.0, 16 mmol/L) 溶解，浓度分别为300.468 umol/L; PMS用蒸馏水溶解,浓度为60 umol/L。取1.50mL不同浓度的样品溶液，0.50mLNBT,0.5mLNADH,混匀,然后加入0.5mLPMS,空白对照是将样品换为1.50mL的缓冲溶液。操作方法相同，25C水浴5min后,在波长560nm下测定吸光度，每样品平行测定三次。超氧负离子清除率I的计算公式如下四:

式中: 1为样晶对超氧负离子的清除率( Scavenging efect);A为样品测试值,A。为空白对照值。

1.2.6.2清除羟基自由基的测定

将桑黄菌丝体多糖用去离子水溶解,配制成一系列不同浓度的样品溶液用。用无水乙醇溶解邻二氮菲,配制浓度为0.75 mmol/L的邻二氮菲溶液,取1.0 mL邻二氨菲溶液分别加人0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH7.40)2.0 mL.和蒸馏水1.0 mL,于漩涡混合器充分混匀后,加人浓度为0.75mmol/L硫酸亚铁溶液1.0 mL,混匀,最后加入0.01% H2O2 1.0 mL,37(C水浴反应60min后,于波长536nm处测定吸光度,损伤管测得的吸光度值标记为A。样品管以1.0mL样品代替损伤管中1.0 mL蒸馏水,操作方法与上述相同,样品管测得的吸光值标记为A2。未损伤营用1.0 mL蒸馏水代替损伤管中的H2O,操作方法与上述相同,未损伤管测得吸光值标记为A,。每样品平行测定三次。羟基自由基清除率1的计算公式如下：

式中:1为样品对羟基自由基的清除率( Scavenging efeet) ;A,为损伤管测试值,A2为样品管测试值,A,为未损伤管测试值。

1.2.6.3还原能力的测定

将桑黄菌丝体多糖用去离子水溶解,制成一系列不同浓度的样品溶液,备用。取1.0mL样品溶液,加人2.5mL铁氰化钾(1% )和2.5 mL PBS(0.2 mol/L, pH6.6) ,混合均匀后于50 C水浴反应20 min。然后再加人2.5 mL三氯乙酸(体积分数为10% )混匀。离心(3000 r/ min,10 min),吸取.上清液2.5 mL, 加人0.5 mL FeCI,(0.1% )混合,于波长700 nm处测定吸光度。以样品溶液的浓度为横坐标，得到的吸光度值为纵坐标绘制曲线。

1.3 数据统计分析

数据以著士表示,采用SPSS17.0软件系统进行数据分析。

2结果与讨论

2.1总糖和蛋白含量测定标准曲线的建立

采用苯酚-硫酸法,在490nm处测定吸光度值，总糖的标准曲线:Y = 0.0064X – 0.0028(R” =0.9970) ,线性范围为10~ 100 μg。

采用考马斯亮蓝法，在595nm处测定吸光度值,蛋白的标准曲线: Y = 0.0135X + 0.0795(R2 =0.9978) ,线性范围为10~60 μg。

2.2提取时间对桑黄菌丝体总糖得率的影响

提取时间对总糖得率的影响见图1。在0.5~2.0h时,得率随着提时间的延长而增加;到2.0h之后,随着时间的继续延长，总糖得率的增加明显平

缓。綜合考虑能耗和时间因素,选提取时间为2.0h。

2.3提取温度对桑黄菌丝体总糖得率的影响

提取温度对总糖得率的影响如图2所示,随着温度的逐渐升高,多糖的含量逐渐增加。温度升高会导致分子动能增加,从而提高溶剂的溶解能力和渗透能力,增加多糖的溶出。一般来说，温度越高提取效果越好，有相关 道认为一般中药采取沸水浴煎煮,因此提取温度选为100 C。

2.4料液比对桑黄菌丝体总糖得率的影响

由图3可见,随着料液比的增加,总糖得率缓慢增加。这是由于在传质过程中,提取剂增加，溶液中糖浓度被稀释,固液两相间糖浓度差增加,从而加快传质速率。但当料液比大于1:15(g/mL)时,总糖得率的增加已不明显，而过大的料液比会造成溶剂的浪费及能量消耗，且加大后续浓缩的难度。因此选择料液比为1:15(g/mL)。

2.5提取次数对桑黄菌丝体总糖得率的影响

提取次数对总糖得率的影响见图4,总糖的得率随提取次数的增加而增大。初始增加提取次数时,得率明显增加,因为每一次提取都采用新鲜溶剂,菌丝体细胞与新鲜溶剂之间的浓度差,促进多糖的溶出。提取次数增加至2次时，得率为14.4% ;3次时,多糖得率达到16.37% ;再继续增加提取次数,多糖得率已无明显增加,说明多糖已经基本提取彻底。考虑到每增加–次提取带来的溶剂及能量消耗以及后续浓缩步骤工作量的增加,将提取次数选定为2次。

2.6 正交实验

在单因素实验的基础上,选取提取时间、提取温度和料液比3个因素作为考察指标,采用L。(3*)正交实验设计.提取次数固定为2次,进行优化桑黄菌丝体多糖的提取工艺条件,正交实验结果见表2,方差分析见表3。

由表2中R值可见,影响总糖得率的因素主次依次是:提取时间(A) >提取温度(B) >料液比(C)。由k值大小可知，优化工艺组合是A,B,C,.由方差分析(表3)同样可以看出提取时间这一因素作用最显著,其次是提取温度,最后是料液比。

按照正交实验得出的最优方案A,B,C,, 即提取时间2.5 h, 提取温度100 C,料液比1:15,3次平行实验，总糖得率分别为14.19%、14.23%和14.08%，平均含量为14.17%，

将在最优方案下提取得到的桑黄水提取液，以80%乙醇沉淀，于4C放置12h后,离心,沉淀复溶、透析冷冻干燥,称重,粗多糖得率为6.64% ,其中多糖含量69.29% , 蛋白含量3.20%。

2.7桑黄多糖化学性质验证

提取的桑黄菌丝体多糖.经过透析、冻干后,表观呈现为白色疏松状粉末,无味，易溶于水，难溶于甲醇,乙醇,乙醚等有机溶剂。碘-碘化钾反应呈阴性,表明桑黄粗多糖中不含淀粉;a-恭酚反应呈阳性，表明所得桑黄粗多糖中含有糖类物质;斐林试剂反应呈现为阴性.表明桑黄粗多糖中不含游离单糖。苯酚-硫酸法测定该桑黄菌丝体多糖中多糖含量为67.89%，蛋白含量为3.59%。

2.7.1紫外光谱检测

紫外1描图谱如图5所示,桑黄菌丝体多糖在196 nm处有明显的吸收峰，表现为糖的特征吸收;扫描260 nm处有吸收峰,表现为核酸的特征吸收,280nm处有少量的吸收，表明有少量的蛋白。

2.7.2红外光谱检测

桑黄菌丝体多糖的红外光谱图如图6所示。

图6显示桑黄菌丝体多糖具有一般多糖在红外光谱中的特殊结构:在3385 cm 左右有较强的0-H和N-H仲缩振动,2930cm~’处有C-H伸缩振动,这两组吸收峰是糖类物质的特征吸收峰;1880-1550cm’之间为C = O的伸缩振动，1650-1500 cm”‘之间为N-H的变角振动,1250~950em-之间存在的吸收峰为吡喃环结构的吸收峰，说明该糖链构型为吡喃型。

2.8桑黄菌丝体多糖的体外抗氧化活性

2.8.1清除超氧负离子的活性测定

桑黄菌丝体多糖和维生素C(V.)对超氧负离子的清除能力见图7。在0.01~0.2mg/mL浓度范围内,随着浓度的逐渐增加,多糖清除超氧负离子的能力缓慢增强。当多糖浓度为0.2 mg/mL时，清除率达到最高,为49.49%。而Vc浓度为0.1 mg/ mL时清除率已经达到92%,与之相比，多糖对超氧负离子的清除率相对较低。

2.8.2清除羟基自由基的活性测定

在 Fenton体系中H,O,与Fe’+反应产生羟基自由基.OH,.OH将邻二氮菲-Fe’氧化成为邻二氮非-Fe”,致使溶液的颜色发生变化,在536nm处的吸收消失或减弱,而具有清除OH能力的物质可与邻二氬菲竞争OH,使得536nm处的吸收减弱程度减小，故由该吸光度值的变化可测定羟基自由基的清除率。

桑黄菌丝体多糖和V。对羟基自由基的清除能力见图8。在0.05~0.4 mg/mL浓度范围内，该多糖对羟基自由基的清除率随着浓度的增加而逐渐增大,浓度为0.2mg/mL时，清除率为28.7%,当浓度为0.4mg/mL时,清除率达到50%;与Ve相比，桑黄菌丝体多糖羟基自由基的清除率较低。这可能是因为Vc为小分子的抗氧化剂,本身具有很强的抗氧化活性,不但能直接清除.OH,还能阻断Fenton反应,减少体系中OH的产生。而对于大分子的多糖来说，OH必须与多糖碳氢链上的氢原子结合成水才能被清除.因而桑黄的各组分多糖清除.OH的活性较差。

2.8.3还原能力的测定

还原能力是检测潜在抗氧化剂抗氧化活性的重要指标。测定原理如下，当反应体系中存在具有还原性物质时，铁氰化钾被还原成亚铁氰化钾，在酸性条件下亚铁氰化钾与三氯化铁反应，生成在波长为700nm处有最大吸收峰的物质,测得的吸光度值越大,则表示该还原性物质的还原能力越强。

桑黄菌丝体多糖的还原力测定结果见图9A.V。的还原力测定结果见图9B。由图可知，在0.1~1.0 mg/mL浓度范围内，桑黄菌丝体多糖的还原力与浓度之间具有很好的量效关系,它们都随浓度的增加而逐渐增加。当浓度为1.0 mg/ml时，多糖的还原力为0.095,桑黄菌丝体多糖的还原能力与Ve相比均相对较羽,可能是由于多糖是大分子物质,其中包含的还原性末端相对较少。

3结论

本实验通过单因素实验和正交实验,采用热水提取桑黄菌丝体多糖,实验结果表明,影响桑黄菌丝体多糖提取率的三个因索的先后顺序是:提取时间>提取温度>料液比。综合考虑各因素得到优工艺参数为:提取时间2.5 h, 提取温度100 C,料液比1:15(g/mL) .提取2次,在该条件下桑黄菌丝体多糖的平均提取率为6.64%。该桑黄菌丝体多糖为白色疏松粉末,无味，易溶于水,不含淀粉和游离单糖,多糖含量为69.29%， 蛋白含量为3.20%。浓度为0.2mg/mL的桑黄菌丝体多糖对超氧负离子的清除率为49.49%,对羟基自由基的清除率为28.7%,还原力为0.072,均低于Vc相对应的抗氧化能力。