神经节苷脂对慢性酒精中毒小鼠海马Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平的影响

摘要

目的

观察神经节苷脂（ganglioside，GM1）对慢性酒精中毒小鼠海马组织Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平的影响。

方法

将40只雄性Balb/c小鼠采用随机区组分组法分为慢性酒精中毒组、对照组、低剂量GM1治疗组、高剂量GM1治疗组，每组10只；慢性酒精中毒组采用酒精灌胃法建立慢性酒精中毒小鼠模型（酒精水溶液浓度逐渐从5%增加至35%)，对照组使用等量生理盐水灌胃，低、高剂量治疗组在酒精灌胃后分别给予GM1（每天10、30 mg/kg）腹腔注射。于灌胃4周后进行酒精偏好实验测试及行为学测试，蛋白质印迹法测定4组小鼠海马组织Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni法。

结果

4组酒水消耗率差异有统计学意义（F=630.83，P<0.05），对照组（18.9%±2.2%）和高剂量GMI治疗组（50.9%±3.2%）酒水消耗率低于慢性中毒组（56.5%±3.0%）。行为学测试结果显示4组悬尾试验累积不动时间（F=379.52）、避暗实验进入暗室潜伏期（F=7 001.18）和进入暗室错误次数（F=33.87）以及疲劳转棒实验小鼠跌落时间（F=305.06）差异均有统计学意义（均P<0.05)，且慢性酒精中毒组行为学测试结果均低于对照组，而高剂量GM1治疗组优于慢性酒精中毒组，差异均有统计学意义（P<0.05）。蛋白质印迹法示，4组Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平差异均有统计学意义（F=12.42、14.07、242.37，均P<0.05）。与慢性酒精中毒组相比，对照组和高剂量GM1治疗组海马组织Caspase-3蛋白和Bax蛋白表达水平显著降低（P<0.05），而Bcl-2蛋白在对照组、高剂量GM1治疗组、低剂量GM1治疗组海马区的表达水平显著高于慢性酒精中毒组（P<0.05）。

结论

GM1可以下调慢性酒精中毒小鼠海马组织Caspase-3、Bax蛋白表达水平，提高Bcl-2蛋白的表达水平。

酒精使用障碍已成为最常见的精神障碍之一，在全球病死和致残的危险因素中位列第三［1］。单唾液四己糖神经节苷脂（ganglioside，GM1）是神经系统中主要的GM1蛋白家族成员，它能阻断神经细胞死亡途径从而起到膜稳定剂的作用［2］。GM1由于具有横穿血脑屏障的能力而被用于治疗中枢神经系统疾病［3］。既往有研究表明，海马区和大脑皮质额叶是酒精神经毒性最敏感的部位，且酒精最早损伤的部位是小脑神经细胞和海马回神经细胞。大脑皮质的神经细胞变性并不显著时, 海马回细胞即出现明显的变性［4］。酒精所致的神经细胞凋亡是慢性酒精中毒脑损伤的主要病理机制，而细胞凋亡是由半胱氨酸蛋白酶（Caspase）所诱导的，而其家族中的 Caspase-3及Bax、Bcl-2更是凋亡通路的关键基因。本研究中采用浓度渐增灌胃法制作慢性酒精中毒小鼠模型，观察GM1作用于慢性酒精中毒小鼠后小鼠的行为学改变，并通过蛋白质印迹法检测小鼠海马组织Caspase-3、Bax、Bcl-2表达水平的变化。

材料和方法

一、材料本研究起止时间为2017年7—12月。

1.动物分组及模型制备：清洁级雄性健康成熟 Balb/c小鼠，每笼饲养5只，共40只，体质量（30±3） g，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供，人工控制饲养环境，每天12 h光照/黑暗循环（光照时间7：00—19：00），温度（22±3）℃，湿度（55±5）%，自由进食。采用随机区组分组法随机分为4组：（1）慢性酒精中毒组：酒精水溶液灌胃（酒精水溶液浓度逐渐从5%增加至35%)；（2）对照组：与慢性酒精中毒组等剂量生理盐水灌胃；（3）低剂量GM1治疗组：酒精水溶液灌胃+GM1每天10 mg/kg腹腔注射；（4）高剂量GM1治疗组：酒精水溶液灌胃+GM1每天30 mg/kg腹腔注射［2］。饲养1周待小鼠适应周围环境后开始进行造模，除对照组外均采用灌胃［5］方法制备慢性酒精中毒小鼠模型：小鼠自由进食，第1周以酒精和水的体积比为5%的初始浓度，按10 ml/kg的剂量取酒精水溶液进行灌胃，第2、3、4周酒精浓度分别为15%、25%和35%。在小鼠行为学测试前1 d停止灌胃，每只小鼠单笼饲养，禁水24 h后同时给予酒精水溶液与水各1瓶，记录1 h内酒水混合液与纯水分别的消耗量，计算各组的酒水消耗率。酒水消耗率（%)=酒水消耗量/(酒水消耗量+纯水消耗量)×100%。

2.主要试剂及设备：无水乙醇（上海阿拉丁试剂公司），兔抗鼠Caspase-3多克隆抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体（沈阳万类生物科技有限公司），注射用单唾液酸四己糖神经节苷脂钠（黑龙江哈尔滨医大药业有限公司），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（上海Santa Cruz公司）、ZB-200疲劳转棒仪、BA-200小鼠避暗仪（成都泰盟科技有限公司）、Odyssey红外荧光扫描成像系统（LICOR公司，美国）。

二、方法

1.行为学评估：各组动物于灌胃4周后进行行为学观察：（1）悬尾实验（tail suspension）测试［6］：使小鼠头部向下，在尾部后1/3处用胶带把小鼠悬吊固定于高处。测试共计6 min，记录后4 min的累计不动时间，精确到秒，用以评估小鼠的抑郁程度。（2）避暗实验（dark/light box test)［7］：训练前将小鼠头朝室壁放入明室，先适应环境，然后打开洞门，由于啮齿类动物的趋暗特性，小鼠会很快进入暗室。小鼠四肢完全进入暗室后，给予1次电击，电击强度为能引起小鼠发声的最小电流。让小鼠在暗室内停留10 s后将小鼠放回笼内。24 h后对小鼠进行记忆测验，记录小鼠第1次进入暗室的时间，以及5 min之内错误的次数，此为避暗潜伏期，5 min内未进入暗室的小鼠其潜伏期按300 s计算，时间以及错误次数用以评估小鼠的学习记忆能力。（3）疲劳转棒实验［8］：小鼠末次灌胃给药30 min后，依次将4组小鼠分别放在疲劳转棒仪上。调节转棒速度为20 r/min，小鼠落下3次后，开始记录各组小鼠由于失去神经系统对平衡功能的调控而从玻璃棒上跌下的时间，记录小鼠在转棒上的停留时间用以评估各组小鼠的平衡能力。

2.蛋白质印迹法（Western Blot）：每组随机取3只小鼠，进行行为学测试后处死，在4 ℃条件下迅速剥离大脑，分离海马组织，冰上研磨组织并加入适量细胞裂解液进行组织匀浆。采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，经过上样电泳及转膜后，蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。室温下用5%脱脂奶粉封闭，4 ℃环境水平摇床封闭2 h。封闭结束后，将膜取出，此实验中使用的一抗分别为一抗Caspase-3抗体（1∶1 000），一抗Bax抗体（1∶1 000），一抗Bcl-2抗体（1∶1 000）；二抗GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育过夜后，用含吐温-20的磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline with tween, PBST）清洗3次PVDF膜，每次10 min。配制二抗（1∶10 000），每张膜上加入500 μl二抗，室温避光孵育2 h。之后回收二抗于-20 ℃。再用PBST清洗硝酸纤维素膜3次，每次5 min。

3.图像的分析处理：采用红外荧光扫描系统检测扫描，以GAPDH作为内参，并用Odyssey软件分析每条条带的灰度值。

4.统计学处理：采用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析，计量资料以xˉ±s” role=”presentation” style=” font-size: 14px; color: rgb(0, 0, 0); display: inline; line-height: normal; text-indent: 0px; text-align: left; word-spacing: normal; overflow-wrap: normal; float: none; direction: ltr; max-width: none; max-height: none; min-width: 0px; min-height: 0px; border: 0px; “>
xˉ±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni法；采用Graphpad Prism绘制统计图，双侧检验P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、慢性酒精中毒小鼠对酒精的依赖程度

酒水消耗率对照组为18.9%±2.2%、慢性酒精中毒组为56.5%±3.0%、低剂量GM1治疗组为54.5%±4.0%、高剂量GM1治疗组为50.9%±3.2%，4组比较差异有统计学意义（F=630.83，P<0.05）。酒水消耗率对照组和高剂量GM1治疗组低于慢性酒精中毒组，组间两两比较差异有统计学意义（P<0.05），低剂量GMI治疗组与慢性酒精中毒组酒水消耗率差异无统计学意义（P>0.05)。

二、行为学实验结果

4组悬尾实验累积不动时间差异有统计学意义，进一步两两比较显示，对照组及高剂量GM1治疗组累积不动时间均小于慢性酒精中毒组（P<0.05)，低剂量GM1治疗组与慢性酒精中毒组累积不动时间差异无统计学意义（P>0.05)。4组避暗实验进入暗室潜伏期差异有统计学意义，进一步两两比较显示，对照组及高剂量GM1治疗组进入暗室潜伏期均大于慢性酒精中毒组（P<0.05)，低剂量GM1治疗组与慢性酒精中毒组差异无统计学意义（P=0.060)。4组小鼠避暗实验进入暗室错误次数差异有统计学意义，进一步两两比较显示，对照组及高剂量GM1治疗组进入暗室错误次数均小于慢性酒精中毒组（P<0.05)，低剂量GM1治疗组与慢性酒精中毒组差异无统计学意义（P=0.328)。4组小鼠疲劳转棒实验跌落时间差异有统计学意义，进一步两两比较显示，对照组及高剂量GM1治疗组跌落时间均大于慢性酒精中毒组（P<0.05)，低剂量GM1治疗组与慢性酒精中毒组差异无统计学意义（P>0.05)。见表1。

三、GM1对慢性酒精中毒小鼠海马组织Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平的影响

蛋白质印迹法示4组小鼠蛋白表达水平见图1。Caspase-3表达水平在4组间差异有统计学意义（F=12.42，P<0.05）。对照组与高剂量GM1治疗组（0.76±0.25) Caspase-3表达水平低于慢性酒精中毒组（1.95±0.57)，差异有统计学意义（P<0.05）；低剂量GM1治疗组（1.47±0.38）与慢性酒精中毒组Caspase-3表达水平差异无统计学意义。Bax表达水平在4组间差异有统计学意义（F=14.07，P<0.05）。进一步两两比较，对照组与高剂量GM1治疗组（1.21±0.46) Bax表达水平均低于慢性酒精中毒组（2.05±0.39)，差异有统计学意义（P<0.05）；低剂量GM1治疗组（1.79±0.22）与慢性酒精中毒组Bax表达水平差异无统计学意义。Bcl-2表达水平在4组间差异有统计学意义（F=242.37，P<0.05），进一步两两比较，对照组、低剂量GM1治疗组（1.65±0.17）与高剂量GM1治疗组（1.93±0.07) Bcl-2表达水平均高于慢性酒精中毒组（0.61±0.04)，差异有统计学意义（P<0.05）。

结果

本研究显示，慢性酒精中毒组小鼠在3项行为学测试的成绩均差于对照组、低剂量GM1治疗组、高剂量GM1治疗组。早期研究均认为长期大量饮酒对学习、记忆、智能、认知等方面的影响是降低慢性酒精中毒患者生活质量的主要因素，长期大量饮酒通过直接损害、影响包括维生素B1、维生素C、维生素E、氧自由基等物质的代谢［9, 10］和对脑血管的损害［11, 12］以及通过产生肿瘤坏死因子、白细胞介素［13, 14］等过程来影响患者的学习、记忆、认知、平衡等方面的功能。本研究显示对照组与高剂量GM1治疗组Caspase-3、Bax蛋白表达水平低于慢性酒精中毒组，差异有统计学意义，而低剂量GM1治疗组与对照组相比差异无统计学意义。对照组、低剂量GM1治疗组与高剂量GM1治疗组Bcl-2表达水平均高于慢性酒精中毒组，差异有统计学意义。细胞凋亡可由多种生理和病理刺激引起，在多种免疫抑制性疾病中普遍存在2种主要的凋亡途径：死亡受体介导外部信 通路的外显途径和线粒体介导的内信 通路。细胞凋亡最重要的影响因子是半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，其是一种凋亡蛋白，参与了受严格调控的蛋白质分解级联［15］；在许多细胞类型中凋亡受Bcl-2家族控制［16］。Bcl-2家族可分为2组：抗凋亡蛋白组和促凋亡蛋白组。抗凋亡蛋白Bcl-2通过调节线粒体膜电位阻断细胞色素C的释放和凋亡诱导因子进入细胞质。而Bax蛋白发挥促凋亡活性。促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间的平衡决定细胞死亡或存活，在体外GM1可以减少Caspase-3 的活性以及酒精诱导的细胞死亡且GM1及其衍生物在酒精毒性模型中有潜在的神经元保护作用。在一些情况下，Bcl-2蛋白的活性可能通过Caspase的切割来调节［17］。Bax蛋白在细胞凋亡过程中，通过内信 通路作用于线粒体，使之释放最终转化为细胞色素C的蛋白，而这种细胞色素C是连接Bcl-2家族和Caspase家族的关键物质，其可以促进Caspase的表达［18, 19］，这与本研究中慢性酒精中毒小鼠海马组织中Caspase-3、Bax的表达水平较对照组均不同程度增高，且二者趋势相一致的结果相符合。同时也证实了慢性酒精中毒脑损伤存在细胞凋亡，这与既往国内外的研究结果相一致。而高、低剂量GM1治疗组中的Caspase-3、Bax蛋白表达水平较慢性酒精中毒组降低，同时高、低剂量GM1治疗组Bcl-2蛋白表达水平均较慢性酒精中毒组升高，且高剂量组优于低剂量组。这提示GM1对慢性酒精中毒后海马组织的细胞凋亡具有抑制作用，且能一定程度的促进抗凋亡机制的发生。因此，本研究显示GM1能抑制慢性酒精中毒小鼠海马组织促凋亡蛋白Caspase-3、Bax的表达水平，促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。本研究暂时只对海马部分进行了蛋白质印迹法的分析，后期可以对皮质及中脑等进行苏木精-伊红（HE染色）以观察组织形态学变化及进行实时荧光PCR检测来验证实验结果。

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