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欧美杨 PdMODD 基因克隆与表达特性分析

张腾倩1，张伟溪1，丁昌俊1，张 静1,，胡赞民2，苏晓华1*

１.林木遗传育种国家重点实验室，国家林业和草原局林木培育重点实验室，中国林业科学研究院林业研究所；2.中国科学院遗传与发育生物学研究所。

MODD( mediator of OsbZIP46 deactivation and degradation)是由Tang 等首次在水稻中鉴定的具有典型EAR基序的转录抑制因子，属于NINJA 家族蛋白。NINJA家族蛋白序列一致性高,都含有A、B、C 3个保守区域,其中A保守区域为EAR基序,该基序是NINJA家族蛋白与协同抑制因子TPL( TOPLESS）和TPRs ( TPL-related proteins)的互作位点;B区域含有一段核定位信 序列;C区域为NINJA蛋白与JAZ( jasmonate zim-domain)互作的位点。

研究表明,水稻MODD基因在ABA信 传导和干旱胁迫应答中具有负调控作用:干旱胁迫下,MODD过表达株系的存活率显著低于野生型，而突变株系增加了对ABA的敏感性和抗旱性;MODD可通过EAR基序结合OsTPR3蛋白招募表观调控因子HDA702抑制OsbZIP46(ABA信 传导正调控因子)活性,通过OsPUB70介导的泛素化抑制OsbZIP46稳定性,进而调节水稻ABA信 传导和抗旱性。此外,MODD还能与水稻中其他干旱正调控因子OsbZIP23和OsbZIP7210相互作用。但是目前关于MODD基因在木本植物中的研究还鲜见 道。

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苏晓华，本刊编委。中国林业科学研究院林业研究所研究员（二级），林木育种首席专家，主要从事林木遗传育种研究。

张腾倩，女，1993年4月出生，林木遗传育种国家重点实验室林木遗传育种专业博士研究生。

关键词：‘渤丰 3 ’杨；PdMODD；生物信息学分析；表达模式分析

基金项目：国家转基因生物新品种培育科技重大专项课题(2018ZX08020002)。

引文格式：张腾倩,张伟溪,丁昌俊,等.欧美杨PHMODD基因克隆与表达特性分析[J].南京林业大学学 (自然科学版),2021,45(2):43-50.ZHANGTQ，ZHANGWX,DINGCJ,et al. Cloning and expression characlteristics of PdMODD genes in Populus × euramericana[J]. Journal of Nanjing Foresty University (Natural Sciences Edition) ,2021,45(2)
:43-50.DOI:10.12302/j.issn.1000-2006.202007015.

1目的

研究杨树重要胁迫响应新基因,为揭示杨树抗逆分子机制、培育优良抗逆杨树新品种提供理论依据。

2方法

基于水稻MODD氨基酸序列,通过BLAST在美洲黑杨基因组中筛选得到3条基因(Podel.08G114100,Podel.10G158900和Podel.17C098500),并以其序列为参考,以‘渤丰3 ’杨cDNA为模板克隆得到3条基因(PdMODD1、PMODD2和PdMODD3)。利用生物信息学分析PdMODD蛋白的结构特征及与其同源蛋白的亲缘关系。通过基因枪轰击法分析PdMODD基因亚细胞定位。采用实时荧光定量(qRT-PCR)技术,分析PdMODD 基因组织特异性和不同胁迫条件下的的表达模式。

2.1 试验材料

实验材料为中国林科院林业研究所杨树课题组自主选育的优良新品种‘渤丰3 ’杨。将生长40d的组培苗炼苗后置于光照时间为16 h、平均温度25℃、相对湿度70%~80%的温室内进行水培，培养液为1/10 Hoagland营养液,培养1周后选取生长状态良好且长势一致的‘渤丰3 ’杨,分别用含有200 mmol/L NaCl和质量分数20%聚乙二醇(PEGoo)的培养液进行处理,同时设以正常培养液培养的对照,在处理0、3、6、12、24、48 h时进行根、茎、叶组织的取材,材料液氮速冻后于-80 °C冰箱保存备用。每个处理,至少3株,3次重复。

2.2 研究方法

基于水稻MODD氨基酸序列,以美洲黑杨( Populus deltoides WV94 v2.1)为参考基因组,利用JGl( https :// phytozome.jgi.doe.gov/ pz/ portal.html#!search? show =BLAST)进行BLAST,筛选出同源性较高（期望值<1×10-10）的3条基因Podel.08G114100、Podel.10G158900和Podel.17G098500,分别以3条基因的CDS序列为参考设计引物,引物序列见表1。以‘渤丰3 ’杨cDNA为模板进行PCR扩增，得到的基因序列分别命名为PdMODD1、PdMODD2和PdMODD3 (GenBank登录 :MW255958、MW255959、MW255960）。其中PCR反应体系为:PCR Mix 10 μL,上下游引物(10μmol/L)各1 μL,模板2 μL,去离子水6 μL;反应程序为:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃l min,35个循环;72 ℃ 10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化后连接pMD18-T载体,转化大肠杆菌感受态DH5a，挑取阳性单克隆经菌液PCR验证后进行测序。

利用NCBI中CD-search ( https ://
www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb. cgi)预测PdMODD蛋白序列的保守结构域。用ProtParam( http:// au.expasy.org/tools/ protparam.html)计算推导PdMODD基因所编码蛋白质的分子质量、理化等电点不稳定系数和亲水性平均系数。用Plant-mPIoc ( http://www.csbio.sjtu. edu.cn/ bioinf/ plant-multi/)预测PdMODD蛋白的亚细胞定位。利用BioEdit对PdMODD的同源蛋白序列进行多序列比对;通过MEGA5.05软件使用Neighbor-Joining(NJ)法对PdMODD及其同源蛋白进行系统进化分析,构建系统进化树。

▼表 1 研究设计的引物序列

3结果

PdMODD1—3基因的开放阅读框(ORF)全长分别为1065,1 065和1074 bp,编码354,354和357个氨基酸,均为不稳定的亲水性蛋白。PdMODD基因均系统进化树分析显示,PdMODD1蛋白与毛果杨PAFP2亲缘性较高并与拟南芥AtAFPl和木薯MeAFP2位于同一个分支;PdMODD2蛋白与麻疯树JcAFP2亲缘关系最近,并与拟南芥AtAFP2聚成一个分支;PdMODD3与毛果杨PtAFP3-1亲缘关系最近,与栓为NINJA家族成员,含有3个保守结构域,其中一个为转录抑制基序EAR。系统进化树分析显示，PdMODD1蛋白与毛果杨PtAFP2亲缘性较高并与拟南芥AtAFPI和木薯MeAFP2位于同一个分支;PdMODD2蛋白与麻疯树JcAFP2亲缘关系最近,并与拟南芥AtAFP2聚成一个分支;PdMODD3与毛果杨PtAFP3-1亲缘关系最近，与栓皮槠QsAFP3、拟南芥AtAFP4属于同一分支。亚细胞定位结果表明PdMODD基因均定位于细胞核。组织特异性分析显示,PdMODD1—3在根、茎、叶中均能表达,且在叶中表达量最高,根中表达量最低。胁迫响应表达模式结果显示,NaCl和聚乙二醇(PEG)胁迫处理下,PdMODD1—3在根、茎、叶组织中主要为显著上调表达。

3.1 PdMODD基因的克隆与序列分析

以‘渤丰3 ’杨cDNA为模板,以在美洲黑杨基因组中筛选的3条基因(Podel.08G114100、Podel.10G158900和Podel.17G098500)CDS序列为参考设计引物,PCR扩增得到3条基因,分别命名为PdMODD1,扩增产物于琼脂糖凝胶电泳检测(图1)。胶回收产物纯化后连接pMD18-T,转化大肠杆菌感受态DH5a,将菌液PCR检测得到的阳性克隆进行测序,测序获得的PdMODD1—3基因序列与美洲黑杨基因组中对应的序列相似度很高，分别为97%、99%和99%。

对PdMODD基因序列进行分析,结果显示PdMODD1—3的开放阅读框（ORF)长度分别为1065、1 065和1 074 bp,分别编码354、354和357个氨基酸(表2)。理化性质分析显示PdMODD分子质量分别为38.83、38.71和39.56 kU ,理论等电点为7.66,8.20和6.05,不稳定系数为60.31,64.18和64.12,亲水性平均系数为-0.847、-0.873和-0.775,均为不稳定的亲水性蛋白。亚细胞定位预测推断3条PdMODD基因编码产物均定位于细胞核。

▲图 1 ‘渤丰 ３ ’杨 PdMODD基因的克隆

▼表 2 PdMODD基因特性分析

3.2 PdMODD蛋白保守结构域及进化树分析

利用NCBI 中CD-search分析PdMODD蛋白保守结构域,结果表明PdMODD蛋白均含有EAR、NINJA_B和Jas保守结构域,属于NINJA家族。通过NCBI 站进行BLAST比对,发现PdMODD与NINJA家族AFP蛋白同源性较高,选择相似度较高的毛果杨、麻疯树、木薯等6种植物AFP氨基酸序列进行比对,结果显示,PdMODD与其他6种植物AFP氨基酸序列长度相近且相对保守,均具有NINJA 家族所特有的3个结构域:N-端高度保守的LxLxL型EAR基序,139~177位相对保守的NINJA_B结构域及C-端Jas结构域(图2)。

为了进一步研究PdMODD与其他 AFP蛋白的亲缘关系,利用MEGA 5.05软件邻接法构建系统进化树,结果(图3)显示,PdMODD1与毛果杨PtAFP2亲缘关系最近,并与拟南芥AtAFP1,木薯MeAFP2聚成一个分支;PdMODD2与麻疯树JcAFP2亲缘关系最近,与拟南芥AtAFP2位于一个分支;PdMODD3与毛果杨PtAFP3-1亲缘关系最近，与栓皮槠QsAFP3、拟南芥AtAFP4聚于同一分支。

▲图 2 PdMODD与其他植物 AFP氨基酸序列多重比对

▲图 3 PdMODD与其他植物 AFP 蛋白系统进化树