导语
PCR是我们的日常实验中最常见的实验之一，看似简单，但很多时候不一定能P出我们想要的目的基因，比如出现非特异性条带或者没有条带。遇到这种情况时，我们往往会调整相关的一些因素，如提高引物特异性，优化Mg+离子的浓度、buffer的pH值、循环条件和退火温度等。由于很多因素都是相互依赖和相互影响的，如dNTPs可以直接螯合一定比例的Mg+离子从而减低游离Mg+离子的浓度影响酶的作用，使得优化条件变得复杂。下面为大家讨论一些优化PCR的策略。
一、没有P出条带或条带亮度很弱
1.尝试额外增加10个循环数，再跑胶检测。
2.提高模板浓度。
3.提高或延长PCR反应中解链温度和时间（标准是95°C，5 min），这样能保证模板DNA能充分变性，使引物能与模板充分结合。
4.调整反应体系中的成分浓度，如pH值，Taq酶，dNTPs和引物浓度等。
5.添加PCR反应增强剂。
6.重新设计引物。
二、出现非特异性扩增或者高分子量的杂带
1.提高退火温度。
2. 调整反应体系中的成分浓度，如pH值，Taq酶，dNTPs和引物浓度等。
3.可以将目的条带的切下来纯化后做模板（可以用酶解或者直接用处理过的牙签刺入目的条带中，再浸没到新的反应体系中），用同样的引物再次扩增。
4.重新设计引物。
影响PCR反应的因素分析
PCR增强剂
不同的添加剂能够加入到反应体系中能提高PCR扩增的特异性，以下是一些常见的增强剂：
二甲亚砜（DMSO，dimethylsulfoxide）（1%-10%）
甜菜碱（Betaine ）（1-2 M）
聚乙二醇（PEG）6000（5%-15%）
甘油（5%-20%）
非离子去污剂（Non-ionic detergents）
甲酰胺（Formamide）（1.25%-10%）
牛血清白蛋白（Bovine serum albumin）（10-100 μg/mL）
目前很多优化了的试剂盒都是通过加入上述的或者其他的一些增强剂来增加PCR的特异性[1]。
退火温度
使用软件设计引物时可得到引物的Tm值，但是软件算出的Tm值不一定是真实反应中的Tm值，因为Tm值受buffer中的成分影响，甚至引物和模板的浓度不同也会影响Tm值，因此在设置退火温度时，Tm值只是作为退火温度的参考，一般我们设置的退火温度是在Tm值得基础上降低5℃。
抑制剂
很多的PCR反应抑制剂已经被 道，如离子去污剂（SDS，sarkosyl(十二烷基肌氨酸)[2]）、苯酚、肝素[3]、二甲苯蓝（xylene cyanol）、溴酚蓝（bromophenol blue）[4]等。如果模板中有以上抑制剂，将模板稀释100倍能有效地去除抑制剂。另外乙醇沉淀和超滤离心也能够解决。
Mg++浓度
参考文献：
[1] Hansen L.L., Justesen J. (2006) PCRamplification of highly GC-rich regions. Cold Spring Harb. Protoc.doi:10.1101/pdb.prot4093.
[2] Weyant RS, Edmonds P, Swaminathan B.1990. Effect of ionic and nonionic detergents on the Taq polymerase.BioTechniques 9:308–309.
[3] Beutler E, Gelbart T, Kuhl W. 1990.Interference of heparin with the polymerase chain reaction. BioTechniques 9:166.
[4] Hoppe BL, Conti-Tronconi BM, Horton RM.1992. Gel-loading dyes compatible with PCR. BioTechniques 12: 679–680.
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