特色树种香叶树、半枫荷种质组织培养技术

特色树种香叶树、半枫荷种质组织培养技术

陈齐明

源枯竭、保护其优良品种的有效途径。

目前有关半枫荷组培的研究 道较少，且主要集中在愈伤组织的诱导、继代等过程 。胡刚等 研究发现比较适合半枫荷继代增殖培养基为: MS +6-BA 0. 5 mg·L－1+ NAA 0. 05 mg·L－1 ，增殖系数为3. 93; 生根培养基以 1/2 WPM + NAA 2 mg·L－1+ 0. 2%活性炭为宜，生根率在 90% 以上。但该研究在增殖和生根过程中均采用单因素试验，研究结果只能在有限的几个处理中得到相对较优的配方，而影响组培苗增殖和生根的因素较多，而且各因素的水平数也较多，因此采用适宜的试验设计开展半枫荷组培研究显得尤为关键。鉴于此，本研究采用半枫荷优良单株当年生萌条为材料，在研究半枫荷外植体消毒的基础上，采用 L 9 ( 3 4 ) 正交试验设计，对其诱导、增殖和生根培养进行较为系统的研究，构建半枫荷优良无性系组培快繁技术体系，以期为半枫荷优质苗木的大规模生产提供参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试的半枫荷优良单株“茫荡 1 ”由南平市顺昌林业科技推广中心选育，以“茫荡 1 ”当年生萌条为外植体材料。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 外植体消毒 剪取半枫荷当年生幼态萌条作为外植体，流水冲去表面污物，用洗洁精清洗 15 min后再用清水反复冲洗干净; 在无菌条件下，先用 75% 的酒精浸泡 1 min，再用 0. 1% 的 HgCl 2 液浸泡 8 ～15min，最后用无菌水冲洗 4 ～5 次。将灭菌后的外植体切取带芽的茎段，长 1. 5 ～2 cm，接入诱导培养基中。7 d 后观察记录外植体污染率、褐化率、成活率。

1. 2. 2 诱导培养

1) 不同基本培养基诱导培养。选用 MS、1/2 MS、4/5 MS、B5 和 White 作为半枫荷诱导的基本培养基，每处理 20 瓶，每瓶接入 5 个芽，每处理 3 次重复。培养 30 d 后，调查统计不同的培养基下外植体丛生芽的诱导率。

2) 不同浓度 6-BA 的诱导培养。以 MS 为基本培养基，加入不同质量浓度( 0. 3、0. 6、0. 9、1. 2、1. 5、1. 8

mg·L－1 ) 的6-BA，研究不同浓度6-BA 对丛生芽诱导的影响。每处理20 瓶，每瓶接入5 个芽，每处理3 次重复。培养 30 d 后，调查统计不同的培养基下外植体丛生芽的诱导率。

1. 2. 3 继代增殖培养 采用 L 9 ( 3 4 ) 正交试验设计，研究不同培养基类型( 改良 WPS、B5、MS 培养基) 、不同 6-BA 质量浓度( 0. 5、1. 0、1. 5 mg·L－1 ) 、不同 NAA 质量浓度( 0. 1、0. 3、0. 5 mg·L －1 ) 和不同 IBA 质量浓度( 0. 1、0. 2、0. 3 mg·L－1 ) 对半枫荷继代增殖的影响。试验共 9 个处理，每处理 20 瓶，每瓶 5 个，3 次重复。培养 30 d 后，调查统计芽的增殖系数。增殖系数 = 现有不定芽数/原接种不定芽数 ×100%。

1. 2. 4 生根培养 采用正交表 L 9 ( 3 4 ) 设计，3 种培养基 ( MS、1/4MS、1/2MS) 和 3 种浓度( 0. 3、0. 6、0. 9mg·L－1 ) 的 ABT、IBA，形成 9 个处理，每个培养基配方中都加入活性炭 0. 2 g·L －1 。各培养基转接长度为 2 ～3 cm 的有效芽苗，每瓶接种 5 个单株，每处理 20 瓶，每处理 3 次重复。先暗培养 5 d 后进行光照培养，生根培养 30 d，观察统计各处理的芽苗生根率和根系生长状况。

1. 2. 5 炼苗与移栽 当生根苗长至 3 ～4 cm 高，根数每株 2 ～3 根，根长达到 1 ～2 cm 后，从培养室转移到炼苗温室，炼苗 14 d 后，将小苗从瓶中取出，洗净根部培养基后，种植于不同基质的穴盘中，栽后喷水保湿并定期喷洒百菌清或甲基托布津等杀菌剂预防病害发生。移栽 30 d 后统计其成活率。

1. 2. 6 半枫荷的培养条件 试验培养基中均添加白糖 30 g·L－1 ，卡拉胶 5. 8 g·L －1 ，培养室温度( 26 ±

1) ℃ ，光强为( 4000 ±200) lx，光照时间 12 h·d－1 ，培养基 pH 值为 5. 8 ±0. 1。

1. 2. 7 数据处理 采用 Excel 2010 和 SPSS 19. 0 软件对实验数据进行统计分析。采用 Duncan’s 方法进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2. 1 不同消毒时间对半枫荷消毒效果的影响

由表 1 可知，随着消毒时间的延长，“茫荡 1 ”半枫荷外植体污染率逐渐下降，但褐化率逐渐增加，而成活率呈先增加后降低的趋势。0. 1% HgCl 2 处理15 min 时，尽管外植体污染率最低，但其褐化率达到最高水平。因此，综合污染率、成活率和褐化率来看，半枫荷外植体消毒最佳方案为 0. 1% HgCl 2 液处理 10 min，在该条件下能达到满意的消毒效果，获得合格的外植体达 90. 25%。

表 1 不同消毒时间处理对半枫荷合格率的影响

* : 同列不同小写字母为 0. 05 水平上差异显著，下同。

2. 2 丛生芽诱导培养

2. 2. 1 不同培养基类型对丛生芽诱导的影响 组培苗增殖过程中培养基类型是影响丛生芽诱导的关键因素。由表 2 可知，“茫荡 1 ”丛生芽对不同培养基类型响应存在显著差异。MS 基本培养基下半枫荷的诱导率最高，达 86. 74%，且芽体生长良好，在基部产生大量的愈伤组织，同时愈伤组织上出现了许多芽点; B5 培养基的诱导效率也较高，达到 81. 28%，但是芽体生长后期缺乏营养，30 d 后芽体上生长出的叶片会出现黄化现象; White 基本培养基对“茫荡 1 ”芽的诱导率最低，仅为 46. 53%。此外，降低 MS 培养基养分浓度对丛生芽诱导效果也不理想，随着养分浓度的降低，丛生芽诱导率显著下降。其中，4/5 MS 下丛生芽的诱导率为 72. 12%，而 1/2 MS 下丛生芽诱导率仅为 49. 48%，而且芽的长势均不理想。因此，MS培养基是“茫荡 1 ”半枫荷茎段丛生芽诱导适宜的培养基。

表 2 不同的培养基对丛生芽诱导的影响

2. 2. 2 不同 6-BA 浓度对丛生芽诱导的影响 6-BA 不同浓度对“茫荡 1 ”丛生芽诱导结果( 表3) 表明，随着 6-BA 浓度的升高，芽诱导率呈先增加后降低的趋势，并在 1. 2 mg·L－1 时诱导率达到最高 ( 93. 74%) ，而当 6-BA 质量浓度超过 1. 2 mg·L－1 时，半枫荷芽诱导率开始显著下降。可见适宜的 6-BA 浓度对半枫荷丛生芽的诱导极为关键，浓度过低不能很好地促进丛生芽的诱导，而浓度过高又会抑制丛生芽的诱导。因此，适合于“茫荡 1 ”半枫荷外植体丛生芽诱导的 6-BA质量浓度为 1. 2 mg·L－1 。

表 3 不同浓度的 6-BA 对丛生芽诱导的影响

2. 3 继代增殖培养

不同培养基类型和植物生长调节剂种类( 6-BA、NAA、IBA) 和浓度对不定芽继代增殖影响的结果见表4 和图 1。Ｒ 值大小反映不同因素对增殖结果的影响大小，研究结果表明各因素对半枫荷继代增殖影响的大小顺序为: 基本培养基 ＞ NAA ＞ IBA ＞6-BA，说明培养基类型是影响半枫荷不定芽增殖的关键因素。根据 k 值结果可知，继代增殖的最佳处理组合为 A 3 B 2 C 1 D 3 ，即改良 MS +6-BA 0. 5 mg·L－1+ NAA 0. 1 mg·L－1+ IBA 0. 3 mg·L－1 。本次试验得出的继代增殖较佳培养基配方为改良 MS + 6-BA 1. 0 mg·L －1+NAA 0. 1mg·L－1+ IBA 0. 5 mg·L－1+ 白糖 30 g·L－1+ 卡拉胶 5. 8 g·L－1 ，继代增殖系数可达 3. 5 倍。

表 4 不同培养基类型和激素对半枫荷不定芽继代增殖的影响

图 1 半枫荷在最佳培养基中继代生长情况

2. 4 不同培养基养分浓度和植物生长调节剂水平对半枫荷生根的影响

由表 5 可知，生根率最高的为处理 2，该处理下半枫荷生根率达到 96． 3%，而且根系粗壮、根数较多; 而生根率最低的为处理 4，仅为 65. 2%。Ｒ 值结果表明不同因素对半枫荷生根影响的主次顺序为:基本培养基 ＞ IBA ＞ ABT。综合 k 值结果来看，半枫荷最佳生根处理组合为: A 1 B 2 C 2 。因此，半枫荷理想的生根培养基配方应为: MS + IBA 0. 6 mg·L－1+ ABT 0． 6 mg·L－1+ 白糖 30 g·L－1+ 卡拉胶 5. 8 g·L－1+ 活性炭 0. 2 g·L－1 。半枫荷在最佳生根培养基中的生根情况见图 2。

表 5 基本培养基及植物生长调节剂浓度对生根率的影响

图 2 半枫荷在最佳生根培养基中的生长情况

2. 5 不同移栽基质对半枫荷移栽的影响

不同移栽基质对半枫荷生根苗移栽成活率具有显著影响( 表 6) 。其中 3 处理: 泥炭土∶ 黄心土∶ 珍珠岩 =7∶1∶2( v/v) 的移栽成活率最高，达 91. 7%; 其次为 2 处理: 泥炭土∶杉木木屑 =5∶5 ( v/v) ，其成活率为 84. 0%，而以泥炭土和黄心土等比例混合的基质移栽成活率最低，这可能是由于该基质配方质地较其他 2 种配方更为紧实，不利于根系的生长和对养分的吸收造成的。因此泥炭土∶黄心土∶珍珠岩 =7∶1∶2( v/v) 是半枫荷组培苗移栽较适宜的基质配方。

表 6 不同栽培基质对半枫荷组培苗成活率的影响

3 结论

本研究建立了以“茫荡 1 ”半枫荷茎段为外植体的组培快繁技术体系，为实现半枫荷规模化生产提供参考。①“茫荡1 ”半枫荷当年生幼态萌条带芽的茎段采用75%酒精浸泡1 min，再用0. 1% HgCl 2 液浸泡 10 min，外植体平均污染率为 8. 09%，成活率达 90. 25%。②半枫荷丛生芽的最佳诱导培养配方为MS +6-BA 1. 2 mg·L－1+ NAA 0. 5 mg·L－1+ 白糖 30 g·L－1+ 卡拉胶 5. 8 g·L－1 ，半枫荷诱导率高达93. 74%。③半枫荷继代增殖最佳培养基配方为改良 MS +6-BA 1. 0 mg·L－1+ NAA 0. 1 mg·L－1+ IBA0. 5 mg·L－1+ 白糖 30 g·L－1+ 卡拉胶 5. 8 g·L－1 ，半枫荷继代增殖系数可达 3. 5 倍。④半枫荷生根诱导最佳培养基配方为 MS + IBA 0. 6 mg·L－1+ ABT 0. 6 mg·L－1+ 白糖30 g·L－1+ 卡拉胶5. 8 g·L－1+活性炭 0. 2 g·L－1 ，生根率可达 96. 30%; 而适合“茫荡 1 ”半枫荷移栽的基质配方为泥炭土∶黄心土∶珍珠岩 =7∶1∶2( v/v) ，半枫荷移栽成活率可达 91. 70%。