ZAR1抗病小体在植物免疫功能的作用机制大揭秘

基本信息

题目：The ZAR1 resistosome is a calcium-permeable channel triggering plant immune signaling

期刊：Cell

影响因子：38.637

Vazyme合作产品：

ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit (货 ：C113，用于2-5个片段快速克隆实验)

作物病虫害是农业生产的重要制约因素，威胁我国食品安全。数目众多的抗病蛋白通过感知病原菌的存在，迅速启动防卫反应、保护植物免受侵害，是农作物稳产高产的重要保障。然而，抗病蛋白的关键作用机制多年来一直是困扰植物抗病领域的重大难题。

先前研究显示，植物先天免疫系统由细胞表面受体和胞内核酸结合的富亮氨酸重复受体（nucleotide-binding, leucine-rich repeat receptors, NLRs）组成，前者感知入侵病原体的免疫原性分子模式，后者感知被传递到宿主细胞中并引发疾病的病原体效应物[1, 2]。同时NLRs也是动物体内重要的先天免疫受体[3]，其在动物免疫反应作用机制的研究相对较多[4]。免疫激活后，NLRs常形成低聚体复合物，其在动物中称为炎症小体，在植物中称为抗病小体[3, 5-7]。由NLRs活化引起的细胞调控死亡被称作植物超敏反应（hypersensitive response, HR），HR反应细胞死亡的本质和潜在机制仍不清晰[8, 9]。

随着研究不断推进，越来越多的病原体效应蛋白可与一种可追溯至1亿多年前的NLR——ZAR1产生互作效应[10-15]。在病原体感染前，ZAR1与一类同源假激酶ZRKs和激酶PBLs相互作用预形成复合物，当病原体效应物进入植物细胞后，该复合物招募被效应物翻译后修饰的PBLs蛋白形成三元复合物[13, 14, 16, 17]，如ZAR1-RKS1-PBL2UMP[14]。前期研究表明活化的三元复合物体外组装形成一个五聚物抗病小体，每个ZAR1的5’-N端螺旋形成一个漏斗状结构并突出于轮状平面，诱变分析显示该漏斗状结构可能具有通道结构（如图1所示）[6, 18]，暗示ZAR1抗病小体很可能通过在细胞膜上成孔，激活免疫反应和细胞死亡。但ZAR1抗病小体是否真的在植物细胞膜上成孔，以及成孔后如何激活下游防卫反应和细胞死亡尚不清楚。这一机制的解析研究对认识植物免疫系统具有重要理论意义。

图1. 抗病小体的活化机制[19]

论文概述

2021年5月11日，中国科学院遗传与发育生物学研究所在国际顶级期刊Cell上在线发表了题为“The ZAR1 resistosome is a calcium-permeable channel triggering plant immune signaling”，关于植物抗病小体的重要研究成果。研究通过植物免疫学、膜生物学、单分子成像和结构生物学等多学科交叉合作，阐明了ZAR1抗病小体的生化功能，揭示了抗病蛋白激活下游免疫反应的机制，对设计抗广谱、持久的新型抗病蛋白，发展绿色农业具有指导意义。

研究思路及结果展示

质粒载体构建

研究人员首先将指定基因的编码序列与pGEMHE2构建重组质粒；随后利用快速克隆试剂盒ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit (Vazyme #C113)，分别将ZAR1和ZAR1E11A的cDNA与xten接头和c端mEGFP，一起连接至pUC19-35S-RBS载体中，并将Col-0的PIP2;1 cDNA单独连接至pUC19-35S-RBS载体中。使用到的其他载体在先前研究中已经得到。

爪蟾卵母细胞ZAR1复合物的活性分析

前期研究结果表明，ZAR1抗病小体最显著的一大特征便是五聚体复合物形成的中心孔[6]，孔内的酸性残基形成羧酸盐环使孔内的内表面通常带负电，这种结构可能有助阳离子的跨膜传导。在本研究中，工作人员通过ZAR1编码区碱基突变并在非洲爪蟾卵母细胞中瞬时表达，并对瞬时表达的非洲爪蟾卵母细胞进行双电极电压钳记录强电流痕迹，确定了Glu11羧酸盐环是ZAR1介导原生质体细胞死亡所必需的，活化的ZAR1具有通道活性，且该活性需要Glu11羧酸盐环（图2）。

图2.在爪蟾卵母细胞中ZAR1抗性小体具有通道活性

ZAR1抗病小体的活性分析

为了更好的研究ZAR1抗病小体的活性，研究人员将预组装的ZAR1抗病小体复合物重组为平面脂质双分子层，并在对称和非对称溶液中进行单通道测量电位。在对称溶液中的测试结果表明ZAR1抗病小体在双层中形成离子通道孔；在非对称溶液中的测试结果表明ZAR1抗病小体对阳离子具有选择性（图3）。

图3.ZAR1抗病小体在平面脂质双分子层中形成阳离子选择性通道

Ca2+作为植物免疫的主要调节因子[20]，前期研究显示Ca2+渗透性通道通过表面免疫受体引导Ca2+离子流并介导免疫反应[21-23]，但没有确定NLR介导的免疫过程中引导Ca2+离子流的确切作用。为了进一步研究ZAR1抗病小体的通道活性对不同离子是否具有选择性，研究人员设置了不同离子组合的非对称溶液条件并测量电位。结果显示ZAR1抗病小体可渗透Na+、K+、Cs+、Mg2+和Ca2+，但具有独特的电流幅度。据此可知，ZAR1抗病小体是一种阳离子选择性通道，可渗透Ca2+（图4）。

图4.ZAR1通道对钙具有渗透性

ZAR1复合物在植物细胞中的活性分析

为了分析ZAR1复合物的活化在植物细胞中是否也表现出类似的特点，研究人员构建得到了一个ZAR1等位基因 告细胞系，从中分离原生质体并进行转染表达待测基因。转染结果显示在植物细胞中，Glu11羧酸环对ZAR1介导的Ca2+内流具有重要作用。随后研究人员利用之前构建得到的病原体效应物无应答ZAR1突变系，将等位基因 告与其进行杂交导入，随后使用对应病原体细菌感染并记录细胞内Ca2+通量，表明ZAR1突变不影响表面受体触发的Ca2+通量。由此可知，ZAR1在植物细胞中触发Ca2+内流的方式依赖于Glu11。

随后研究人员通过融合了mEGFP的ZAR1-mEGFP质粒与RKS1、PBL2和病原体效应物一同转染到拟南芥ZAR1原生质体，利用单分子成像和TIRF成像的方式来确定活化的ZAR1蛋白在植物细胞原生质体中的形态与亚细胞定位。结果显示，多数ZAR1-mEGFP点呈非均匀但多数可移动的正态扩散，通过荧光强度分布校正后，发现分子以低聚体分布，且大多含有5个左右的分子，且ZAR1低聚体与添加mCherry标记的质膜驻留蛋白PIP2;1扩散动力学相一致，定位于质膜，不存在于内质 中（图5）。表明ZAR1抗病小体位于植物细胞质膜中。

图5.单分子成像显示细胞表面形成ZAR1低聚体

ZAR1活化对植物细胞的影响

研究人员使用荧光素二乙酸（Fluorescein diacetate, FDA）与碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）组合及活细胞成像技术来观察ZAR1活化介导的植物细胞死亡。ZAR1引起的植物细胞死亡类似于动物细胞的焦亡和坏死，均由成孔蛋白引起，动物细胞坏死时会发生渗透性膨胀并最终爆炸；发生焦亡时，细胞在破裂前出现气泡状突起[24, 25]。研究结果显示，在使用病原体接种感染后，FDA最初局限于活细胞的胞质并展现出完整的质膜结构，接种3.5小时后，FDA信 减弱，PI进入细胞，质膜完整度降低，细胞质流动和叶绿体运动性下降并停止，最终因细胞核的突然解体和细胞坍塌而终止。但在该过程中，始终没有观察到细胞肿胀和质膜突起。
此外，研究人员使用了与PI功能类似的染料SYTOX Red和延时活细胞成像技术对ZAR1诱导原生质体死亡的过程进行记录，以了解ZAR1诱导植物细胞死亡的动态过程。在转染6小时后，ZAR1介导的原生质体被SYTOX Red染色，表明质膜完整度降低；转染8-9小时后，原生质体死亡，在整个过程中同样没有观察到肿胀或质膜突起现象。但有趣的是，SYTOX Red信 最初出现在单个叶绿体中，随后被染色的叶绿体数量不断增多，最终染色整个原生质体直到破裂，表明叶绿体在细胞破裂前变已经受损。针对细胞死亡与ROS的检测结果显示，ZAR1介导死亡的原生质体在PI染色前ROS水平持续升高。上述结果表明，ZAR1活化时，细胞器首先受损，依赖ZAR1通道的ROS开始生成，随后质膜的完整度发生损伤，最终细胞解体死亡，该过程中没有出现细胞肿胀或质膜突起

Vazyme产品支撑

诺唯赞（Vazyme）的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit (C113)多片段快速克隆试剂盒助力该项研究，研究人员在构建ZAR1和ZAR1E11A的cDNA与xten接头和c端mEGFP与pUC19-35S-RBS载体的连接重组时，均使用该产品完成操作。ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit (C113)作为新一代重组克隆试剂盒，独特的非连接酶依赖体系，极大地降低了载体自连背景，阳性率可达95%以上。该产品可用于2-5个片段与载体的一步重组构建。

C113产品相关信息

产品名称及货 ：

ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit (货 ：C113)

产品优势：

1. 可在几乎任何载体的任意位点进行多片段拼接克隆

2. 无需考虑插入片段自身携带的酶切位点

3. 可一次实现二至五个插入片段的顺序拼接

4. 提供在线引物设计软件CE Design

C113其他高分文献引用

参考文献

[1] JONES J D, VANCE R E, DANGL J L. Intracellular innate immune surveillance devices in plants and animals [J]. Science, 2016, 354(6316):

[2] ZHOU J M, ZHANG Y. Plant Immunity: Danger Perception and Signaling [J]. Cell, 2020, 181(5): 978-89.

[3] DAVIS B K, WEN H, TING J P. The inflammasome NLRs in immunity, inflammation, and associated diseases [J]. Annu Rev Immunol, 2011, 29(707-35).

[4] LIU X, LIEBERMAN J. Knocking ’em Dead: Pore-Forming Proteins in Immune Defense [J]. Annu Rev Immunol, 2020, 38(455-85).

[5] MA S, LAPIN D, LIU L, et al. Direct pathogen-induced assembly of an NLR immune receptor complex to form a holoenzyme [J]. Science, 2020, 370(6521):

[6] WANG J, HU M, WANG J, et al. Reconstitution and structure of a plant NLR resistosome conferring immunity [J]. Science, 2019, 364(6435):

[7] MARTIN R, QI T, ZHANG H, et al. Structure of the activated ROQ1 resistosome directly recognizing the pathogen effector XopQ [J]. Science, 2020, 370(6521):

[8] MUKHTAR M S, MCCORMACK M E, ARGUESO C T, et al. Pathogen Tactics to Manipulate Plant Cell Death [J]. Curr Biol, 2016, 26(13): R608-R19.

[9] PITSILI E, PHUKAN U J, COLL N S. Cell Death in Plant Immunity [J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2020, 12(6):

[10] LAFLAMME B, DILLON M M, MARTEL A, et al. The pan-genome effector-triggered immunity landscape of a host-pathogen interaction [J]. Science, 2020, 367(6479): 763-8.

[11] LEWIS J D, WU R, GUTTMAN D S, et al. Allele-specific virulence attenuation of the Pseudomonas syringae HopZ1a type III effector via the Arabidopsis ZAR1 resistance protein [J]. PLoS Genet, 2010, 6(4): e1000894.

[12] ADACHI H, SAKAI T, KOURELIS J, et al. Jurassic NLR: conserved and dynamic evolutionary features of the atypically ancient immune receptor ZAR1 [J]. 2021, 2020.10.12.333484.

[13] SCHULTINK A, QI T, BALLY J, et al. Using forward genetics in Nicotiana benthamiana to uncover the immune signaling pathway mediating recognition of the Xanthomonas perforans effector XopJ4 [J]. New Phytol, 2019, 221(2): 1001-9.

[14] WANG G, ROUX B, FENG F, et al. The Decoy Substrate of a Pathogen Effector and a Pseudokinase Specify Pathogen-Induced Modified-Self Recognition and Immunity in Plants [J]. Cell Host Microbe, 2015, 18(3): 285-95.

[15] SETO D, KOULENA N, LO T, et al. Expanded type III effector recognition by the ZAR1 NLR protein using ZED1-related kinases [J]. Nature plants, 2017, 3(17027).

[16] MARTEL A, LAFLAMME B, SETO D, et al. Immunodiversity of the Arabidopsis ZAR1 NLR Is Conveyed by Receptor-Like Cytoplasmic Kinase Sensors [J]. Frontiers in plant science, 2020, 11(1290).

[17] LEWIS J D, LEE A H, HASSAN J A, et al. The Arabidopsis ZED1 pseudokinase is required for ZAR1-mediated immunity induced by the Pseudomonas syringae type III effector HopZ1a [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013, 110(46): 18722-7.

[18] HU M, QI J, BI G, et al. Bacterial Effectors Induce Oligomerization of Immune Receptor ZAR1 In Vivo [J]. Mol Plant, 2020, 13(5): 793-801.

[19] KNIGHT H, TREWAVAS A J, KNIGHT M R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation [J]. The Plant cell, 1996, 8(3): 489-503.

[20] TIAN W, WANG C, GAO Q, et al. Calcium spikes, waves and oscillations in plant development and biotic interactions [J]. Nature plants, 2020, 6(7): 750-9.

[21] TIAN W, HOU C, REN Z, et al. A calmodulin-gated calcium channel links pathogen patterns to plant immunity [J]. Nature, 2019, 572(7767): 131-5.

[22] WANG J, LIU X, ZHANG A, et al. A cyclic nucleotide-gated channel mediates cytoplasmic calcium elevation and disease resistance in rice [J]. Cell Res, 2019, 29(10): 820-31.

[23] THOR K, JIANG S, MICHARD E, et al. The calcium-permeable channel OSCA1.3 regulates plant stomatal immunity [J]. Nature, 2020, 585(7826): 569-73.

[24] CHEN X, HE W T, HU L, et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis [J]. Cell Res, 2016, 26(9): 1007-20.

[25] SHI J, ZHAO Y, WANG K, et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death [J]. Nature, 2015, 526(7575): 660-5.

原文链接：

https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092-8674(21)00600-0