实时荧光定量PCR（qPCR）技术在生物制品质量控制方面应用非常广泛，如宿主DNA残留检测，鼠源、禽源等外源病毒检测，微生物快检（支原体、分枝杆菌、细菌、真菌等），复制型病毒检测（RCL、RCR、rcAAV等）、质粒拷贝数检测及其它工艺杂质检测等。
qPCR检测结果以扩增曲线图呈现，正常扩增曲线为S型，分为基线期、指数扩增期、线性扩增期和平台期；线形光滑、拐点清晰，基线平直或略微下降，无明显上扬。定量检测实验中，对标曲的要求主要从斜率（与扩增效率相关）和R2两方面进行考察，要求斜率满足-3.8~-3.1（对应扩增效率为83.3%~110%），R2满足高于0.99。
标准S型扩增曲线
受试剂品质、人员操作、硬件系统、分析软件、参数设定等多种因素影响，实际实验过程中经常出现样品或参考品DNA异常扩增的情况，需要从以上各方面入手综合分析原因。
异常扩增的正确分析需要实验人员具备丰富的实操经验，湖州申科对日常检测中出现的异常扩增实例进行了梳理总结，分析其可能原因并提供相应解决方案，供qPCR实验人员参考：
1.扩增效率超出标准要求（低于83.3%或高于110%）
■ 设计的引物探针不适用：重新分析靶标序列进行设计。
■ 标曲浓度设定太高，超出标曲线性范围：对范围进行验证，选取合适标曲范围。
■ 人员操作问题，如稀释错误、制备过程震荡时间过长等：人员上岗前应接受全面培训并做到熟练操作，考核合格后方可上岗。
■ 移液器未校准或品质问题导致量取不准：定期对移液器进行校准并选择高品质的移液器。
扩增效率异常曲线
2.软件设置不合理导致曲线异常
软件参数设置不当可能引起标曲参数或检测结果异常。左图中扩增曲线信 最早出现在14个循环左右，基线设置为3-15，导致仪器将14个循环出现的荧光信 默认为基线部分，出现结果异常。建议将Baseline End设置为扩增信 出现的前一个循环，或由软件自动设置（右图）。
3.标曲无扩增曲线或仅出现部分扩增曲线
■ 运输条件异常或保存条件不当导致试剂性能受损。仔细核对货物状态和运输条件；严格按照标示要求进行保存，实验结束后及时置合适环境保存。
■ 试剂处理方式错误，严格按照说明书操作。
■ 软件参数设置错误，根据说明书要求进行参数设置。
■ 硬件条件不满足要求，如个别设备要求反应体积不超过25μL，无法满足30μL反应体系。提前了解设备硬件条件，如有必要可考虑配置合适参数的设备。
4.扩增曲线“飘起”
该现象通常出现于高浓度模板情况下，扩增曲线Ct值在10以内的样品。针对此类样品检测，设置标曲时建议尽量控制标曲最高浓度Ct值控制在10以上。检测样品时建议对样品进行稀释后再测试。
扩增曲线“飘起”
5.非特异性扩增现象
■ 反应管未盖紧或密闭性差引起溶液蒸发而造成。上机前确保管盖密闭，反应结束后查看八联管或96孔板各管液面是否一致。
■ 与设备硬件相关，需咨询硬件供应商解决。
左：斜直型扩增曲线 右：反应管溶液变化
6.扩增曲线末尾“起跳”
■ 阴性质控或无模板对照曲线末尾出现起跳情况，考虑环境存在污染所致，建议对实验环境做好控制，如使用低吸附带滤芯枪头和低吸附ep管，实验分区（阴阳性分开）、DNA清除剂处理环境等。
■ 待测样品曲线末尾出现起跳情况，在确保阴性质控或无模板对结果正常的情况下，可以进行复测，复测结果一致，则考虑是样品中待测物浓度较低所致。
扩增曲线末尾“起跳”
7.扩增曲线不平滑
可能与ROX加入量不足相关，个别设备有ROX校正功能，不同型 设备对ROX的需求量会有差异，需设置实验摸索合适的ROX加入量。
扩增曲线不平滑
8.扩增曲线复孔间荧光信 值降低及复孔间扩增曲线重复性差
■ 复孔间部分曲线荧光信 值降低的现象比较常见，通常与反应管内存在气泡相关，随反应温度升高，气泡破裂导致荧光信 值降低。上机前需仔细检查反应管内是否有气泡残留。
■ 另外，针对加样误差引起的复孔间重复性差，实验人员上岗前需加强培训并考核，移液器务必定期校准并正确掌握使用方法。此外，还需注意确保试剂与样品混匀，离心后再上机。
复孔间扩增曲线荧光信 值低、重复性差
END
版权声明 | ?HZSKBIO 未授权不可使用
声明：本站部分文章及图片源自用户投稿，如本站任何资料有侵权请您尽早请联系jinwei@zod.com.cn进行处理,非常感谢！