图1. 番茄根际细菌的分离与鉴定示意图
4.根际分离细菌产铁载体能力测定
4.1将菌种活化，从-80 ℃冰箱中取出保存的甘油菌种，利用手动移液工作站转移5 μl甘油菌种至一个新的96孔板，每孔含有195 μl TSB培养基，于170 rpm 30 ℃摇床中培养过夜。
图3. 自动移液工作站
4.6为了消除CAS测定方法产生的背景值，按照上述实验步骤检测了两种已知产铁载体的菌株 (Pseudomonas aeruginosa PAO1 和 Burkholderia cepacia H111) 及其相应的铁载体缺陷型突变株 (铁载体非生产者P. aeruginosa PAO1△pvdD△pchEF 和 B. cepacia H111△orbJ△pchAB) (Ghysels等 ，2005, Sathe等 ，2019) 在限铁条件下的铁载体产量。然后使用两个铁载体缺陷型突变株的CAS测定值的平均值作为检测背景值和铁载体生成之间阈值的分界线。
图5. 2150株根际分离细菌的多样性和分类
3.根际细菌铁载体产量的测定结果：
3.1采用CAS 法对所有分离得到的2150株根际分离细菌上清液中的铁载体进行检测。由于上清液中可能存在一些有机酸和其他对铁具有低结合能力的分泌物对CAS的检测值会产生阳性干扰。为了在一定程度上消除这些背景值对CAS法检测结果的影响，按方法中所述，在对所有菌株检测的过程中增加了两株已知高产铁载体菌株和它们对应的铁载体缺陷型突变体的CAS检测，在限铁条件下培养48 h后这四株菌的上清液的CAS检测结果如图6A，两株野生型菌株的铁载体产量均在0.75以上，而它们对应的两株相同基因型的突变菌株虽然都不产铁载体，但CAS检测值却仍分别有0.29和0.26。
3.2因此，选取两株非铁载体生产菌株的平均值0.275作为CAS检测的背景值，用于 矫正根际细菌铁载体产量，区分铁载体生产菌株和非生产菌株。结果显示，限铁条件下约95%的根际分离细菌可以分泌铁载体；而富铁条件下绝大多数根际细菌不分泌铁载体，但是仍存在少部分菌株依然可以分泌铁载体 (图6B) 。
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