[生命科学] snapgene 构建载体方法分享

snapgene 构建载体方法分享

文章目录

• snapgene 构建载体方法分享
• 1. Snapgene 构建载体—酶切位点法
• 2. 载体构建——同源重组法
• 3. 总结

1. Snapgene 构建载体—酶切位点法

3. 打开页面后，复制全部序列。

5. 黏贴复制文件，并重命名DNA文件，点击OK。

7. 从Star开始CSD序列前25个左右碱基，此时注意温度最好在60度左右（22-40碱基数目之间都可以），点击Primers>add primer>top strand，点OK。

8. 从END开始CSD序列后25个左右碱基，此时注意温度最好在60度左右（22-40碱基数目之间都可以），但也要兼顾碱基的长度，如果太长则不好扩增PCR。点击Primers>add primer>bottom strand，点OK. 这一步先做到这，后续再添加酶和碱基。

9. 点击Emazy>choose emazy>先移除右边框中的酶，然后再添加你所在实验室中已有的酶，我在这里随便选了6种。如下图所示，然后点确定。

11. 打开载体以pGADT7 AD为例，查看切入位点的酶有哪些。在筛选的过程中还要注意酶切位点不能把基因切断。因此在选择酶切位点时候要保证两点。1.载体中多克隆位点中包含该限制性内切酶。2.目标基因可酶切的位置不包含该限制性内切酶。点击图中标记的地方MCS（多克隆位点）插入基因的位置。

13. 查看可以插入的酶切位点后，返回到目的基因的DNA文件。点击primer forward序列，点击Insertions,第一列绿色方框不要管，这个方框是用来添加氨基酸，在构建载体过程不需要调整。把第二列红色方框改成第一个酶切位点基因Nde1, 然后点击insert.并在前面添加G或者C为保护碱基（也可以 络查询适用的保护碱基）。

得到如下结果后点击保存文件。

17. 得到结果如下图所示。在Vector界面选择两个酶切位点，注意两个酶切位点的顺序。

20. 检查：返回到碱基序列查看我们之前插入的两个酶切位点是不是为当时插入的基因序列，有没有错误，以及插入片段是否完整。

3. 总结

同源重组法比双酶切酶位点法要简单很多，步骤也要少的多，但假阳性率略高。 不过从实践经验来看，同源重组挺好用，比较推荐。