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原文为自自Microbial association network construction tutorial http://psbweb05.psb.ugent.be/conet/microbialnetworks/index.php

简介Introduction

必须软件Prerequisites

最新版Windows版 Cytoscape下载并安装 http://www.cytoscape.org/
在Cytoscape的App Manager中安装CoNet和CytoCluster http://systemsbiology.vub.ac.be/conet
注册MENA web server: http://129.15.40.240/mena/
安装LSA http://hallam.microbiology.ubc.ca/fastLSA/install/index.html
Spacc安装 https://bitbucket.org/yonatanf/sparcc
注册在线微生物管理平台Qiita: microbial study management platform https://qiita.ucsd.edu/ # username: woodcorpse@163.com
安装biom: include by QIIME，末安装可先参考安装QIIME
安装R包igraph用于可视化SparCC结果

示例数据 Data

Environmental Microbiology 12(11), 2998-3006 (2010).
http://psbweb05.psb.ugent.be/conet/microbialnetworks/files.php

MENA

http://129.15.40.240/mena/ 自己注册个新用户

上传数据：Upload your dataset, arctic_soils_filtered.txt
构建络：Construct the network, 选择数据submit，参数为1，keep blank, do not take alogarithm,其它为默认，Submit
查看结果：回主界面，点击Search datasets and networks，每个有项目名、参数和最右边有运行状态，done为完成；点结果列表的名字可看结果，选择不同参数构建络 Constrcut the netowrk;
分析络：Analyze the networks — Network reports，点击每项按默认参数执行; 如Global Network properties，络属性，如边、点数据信息；Individual nodes’ centrality为每个点的属性，如node.degree， Clustering.Coefficient；Module Separation and modularity calculation
可视化：分析络中的可视化，可以在线简单成像，也可下载cytoscape格式sif文件及边点注释文件本地分析；并替换所有_为-，替换np为pp，便于后期与Conet比较
Cytoscapes分析：打开软件

打开络文件 File — Import — Network — File — arctic 0.540.sif;
打开点属性 File->Import->Table->File — node attribution文件；
布局设置 Layout->yFiles Layouts->Organic;
设置颜色 style,在样式右链下前头中选择 new style,输入名字如“mena”，再设置Fill color的Map选项，Column选择No. module按模块编上色，Mapping type选择Discrete Mapping，再手动调置每一类的颜色。
导出位图和矢量图；File – Export – Network view as Graph – 分别选择pdf和png保存，png大小为200%,dpi=300；但有时图像尺寸会有问题，需要用AI调整PDF，再输出png或tiff；调整后结果如下：保存至本地。

SparCC

络接口工具，对数据组成的的鲁棒性更强(0和极大值处理更好)；

相关系数矩阵结果使用R可视化，本地或Rstudio服务器

络分析 Network analysis

比较Conet与MENA的一致性
保存Conet为sif格式：File – Export – NetWork – conetNetwork.sif；
修改其格式与MENA一致便于比较：用Editplus打开conetNetwork.sif，用正则表达式替换tt为tppt；
使用Cytoscape打开:Import – Network – File打开，
比较点和边：Tools – Merge – 选择两络添加至右边，选择Intersect，再点Merge; 看到只有62个点和16条边重合，重合的边极少/p>
全局络分析 Global network analysis
Tools->Network Analyzer->Network Analysis->Analyze network，选择默认的无向络undirected，确定，可获得络的属性的面板，包括络参数、密度、样式路径长度和簇系数、节点度分布、节点特异属性(such as 离心率eccentricity and 中介中心性betweenness centrality)
中心节点Hub nodes
分析后的络点有很多属性，按degree排序即可找到中心节点，本数据为Acidobacteria。
络聚类Network clustering
基因表达络中，簇用来预测未知功能的基因，与表达相似基因功能相近。微生物相关络可以发现相似的生活方式。
先选择正相关的边：从Cytoscape选择，没成功；CoNet输出的为正相关络，方法链接也没説具体操作；
打开Apps – CytoCluster，选择 OH-PIN algorithm ，点Analyze current network。结果显示在另一个面板上，有一些clusters，按由大到小排列。比如我们想分析第一个cluster的物种属性，选择cluster1，点Creat sub-network，可查看该子按之前物种颜色分类的结果。
联合环境因素分析 Neighbors of environmental parameter
选择pH点(没找到，再点邻近的点，可找到相pH正或负相关的OTU

结论 Conclusions

络是精糙无标度(适应结点度分布的权力法则)和小世界(路径长度短特点);
如果只看正相关边，络分为两个主要的簇，由不同的分类学群主载；
如果看pH值的邻近节点，发现两个负相关的簇：一个与pH正相关，另一个相反；
对于生物学观点，全局络属性意义不大。然而，络形成两个物种分类学特异的簇，暗示苔原土壤存在两个不同的微生物群落。人类也观察到在肠道和阴道中有明显不同的微生物群落。可变的微生物群落是有争意的，因为不清楚群落是否真的不同，还是梯度的渐变。我们可以接受这两种差点，因为有一些部分是重叠的。
当探索临近的pH结点，我们看到Solibacteres和Acidobacteria在其中一个正相关簇中占主导，并与pH呈负相，意味着它们喜欢酸性环境。我们看到另一个簇中Chloracidobacteria和Alphaproteobacteria占主导，且与pH正相关。这些微生物更喜欢基础环境。
结论是土壤pH驱动微生物群落改变。与数据原文结论一致。
此外，我们还发现了更细分类单元与pH的相关性。如Acidobacteria门中的Chloracidobacteria纲与pH正相关，是该门中的特异的纲。结果可以根据pH反苔原土壤中的主要细菌门类。

名词解释 Resources

CoNet无向络：为什么CoNet返回的是无向络用于选择配置。答案是所有5个选择相似、不相似和相关测量是不对称的，相似的A与B与B与A是相同的。
CoNet和Cytoscape中心节点的检测：找有最多正或负相关边的节点，在Node table中，点Degree即按其排序，找到最多度的点。
从随机千分文件中恢复CoNet 络 Restore the CoNet network from random score files：为了基于之前计算好的permutations and bootstraps文件而生成络。
正相关边的聚类：为什么只聚类正相关的边，因为我们感兴趣在一起的物种共有一些特征。大部分聚类算法不能区分正或负相关的边，负相关的也会聚类在一起。
Cytoscape中选择正相关边：Select -> Use filter(找不到, choose “edge.interactionType” as column and click “Add”. Select “copresence” and click “Apply Filter”. Go to Select -> Nodes and click “Nodes connected by selected edges”. Go to File -> New -> Network and click “From selected nodes, selected edges”. Finally, layout the network (e.g. Layout->yFiles Layouts-> Organic).

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