图1. 根盒采样装置示意图（A、B）及根室中根系实物图（C）。（A）根盒由三层圆柱体组成，内层(根室)由50微米的尼龙 组成，防止根系进入中间层，外层由4毫米的金属 组成，以支撑根箱。（B）中间取样层为18个单独的尼龙 袋(尼龙 孔径为150微米，高136毫米，宽18~21毫米，厚1~2毫米)，包含均质和灭菌的田间土壤。中间层尼龙 袋土壤与植物根系及根系分泌物接触密切，可作为根际土壤。（C）番茄幼苗移栽至根盒中3周、6周后，中央根室被密集的植物根系占据。
4根盒田间安置、根室土壤制备及土体土采集
根盒田间安置点位于南京市麒麟镇后村 (即供试土壤采集田块)，用土钻在试验田打孔，制成孔径和深度刚好适合根盒装置大小的孔洞(即136 mm深，底面直径110 mm)，然后将根盒安置于孔洞内。为了消除位置效应的影响，且使所采集的根际样品具有代表性，所有根盒被安置在随机选择的三个田间小区内，每个小区安置16个根盒 (共48个根盒)，依据田间番茄栽植密度，每个根盒间隔30 cm (图2A)。经土钻采集到的土壤首先去除植物残体和石块，混匀后于采集当天放置于根盒的根室中。
上述操作完成后，采用 1 cm 内径土钻在根室的三个相对位置以及贴近根盒外围的三个相对位置分别采土 (采土深度136 mm) 并混匀，混匀土壤即为初始土壤 (Initial soil，土体土)。
5根室番茄植株的种植及根际土采集
将培养三周的番茄幼苗用无菌水洗去育苗基质后移栽到田间根盒装置的根室土壤中。每个根室移栽一株番茄苗 (共 48 株番茄)。移栽三周后对根盒内部番茄的生长情况进行观察，确保番茄根系长满根室土壤 (图1)。
每个采样时期采集根盒中层相对位置的3个含土尼龙 袋，即用镊子将根盒中层尼龙 袋上沿拔出，用大拇指和无名指捏紧尼龙 袋上沿轻轻晃动将其抽出(根际尼龙 袋采集动画详见链接，Movie S1. Method of sampling middle-layer nylon bags from rhizobox: https://advances.sciencemag.org/content/5/9/eaaw0759/tab-figures-data)，混匀其中土壤后置于-80 °C保存。共采集48株番茄在营养生长阶段一 (Vegetative stage 1，VS1，移栽后三周)，营养生长阶段二 (Vegetative stage2，VS2，移栽后四周)，生殖生长阶段一 (Reproductive stage 1，RS1，移栽后五周) 和生殖生长阶段二 (Vgetative stage 2，VS2，移栽后六周) 个时期的根际土壤 (图2B)。
图3.不同健康状态番茄的茎部病原菌数量(A)及田间根盒中番茄植株健康状况示意图（B）. （A）番茄植株茎部病原菌数量采用平板涂布计数方法检测。***表示显著性p
7土壤DNA的提取
每个土壤样品取 0.5 g 并采用 PowerSoil DNA 提取试剂盒(Mo Bio, Carlsbad, CA,
USA)按操作说明提取 DNA，将提取的 DNA 用 NanoDrop (ThermoScientific, Wilmington, DE, USA)检测质量 (A260/A280)和浓度（核酸质量≥50ng，浓度≥1ng/μl，体积≥50μl， OD260/280=1.8-2.0，样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物）。
816S rRNA 基因扩增及测序
采用引物563F (5’-AYTGGGYDTAAAGVG-3’) 和802R (5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3’) (Cardenas等, 2010) 对细菌 16S rRNA 基因 V4 高变区进行 PCR 扩增，PCR 体系 (20 μl)为 4 μl 5X FastPfu buffer， 2 μl 2.5 mM dNTPs， 0.4 μl 引物 (5 μM)，0.5 μl DNA 模板和 0.4 μl FastPfu DNA 聚合酶 (TransGen Biotech, Beijing, China)。PCR 包含 30 个循环条件为：95℃ 30 s 预变性， 55℃退火 30 s， 72℃ 延伸 30 s。扩增产物先用 AxyPrep PCR Clean-up Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) 纯化， 然后进行琼脂糖凝胶电泳。纯化后的扩增产物用 QuantiFluorTM-ST (Promega, WI, USA)定量后，送至上海美吉生物公司进行双向 250 bp Miseq 测序。
9序列处理
扩增子测序结果降噪采用 UPARSE 标准处理流程 (Edgar, 2013)，首先将同一样品的正反向序列对进行拼接、去除低质量核苷酸 (最大错误率 0.25) 以及长度低于200bp 的序列，然后将序列按 97%相似性进行操作分类单元 (Operational taxonomic unit, OTU) 分配并去除嵌合体。利用 Mothur 软件对UPARSE处理获得的代表序列和 OTU表进行后续分析。测序深度统一至序列数最少的样品的测序量，OTU 的分类地位经 RDP 16S rRNA classifier (Wang等, 2007) 比对获得，置信度阈值设为80%。
结果与分析
不同生长阶段健康和发病植株相关土壤细菌群落结构组成差异结果：
基于非权重UniFrac距离矩阵的主坐标分析显示 (图4A)，健康和发病番茄具有特异性的起始土壤细菌群落组成 (即初始土壤细菌群落能依据番茄的最终健康状态显著聚类，p
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