学位论文精读-hBMSCs在肿瘤微环境中分泌IL-6并上调IL-17水平协同促进DLBCL生长的研究

摘要

弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是最常见的非霍奇金淋巴瘤亚型，是一种侵袭性淋巴瘤。虽然近年来一线的化疗方案R-CHOP（利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松）改善DLBCL患者的预后，但是仍有相当一部分的DLBCL患者因化疗耐药而出现进展或复发，这是困扰临床治疗的一大难题和挑战。目前DLBCL患者出现化疗耐药和复发的机制仍然不清楚，值得我们进一步研究。已有研究发现利妥昔单抗耐药与间充质干细胞相关，本研究将阐明DLBCL患者化疗耐药和复发间充质干细胞的关系，阐明其具体的机制，为临床进一步解决DLBCL患者化疗耐药单核复发提供新的靶向治疗的策略。
这篇文章主要采用CCK-8检测细胞株（SU-DHL-2和SU-DHL-4）的增殖，克隆形成实验检测DLBCL细胞克隆形成能力，用异种移植小鼠来验证DLBCL在体内的生长。分别用免疫组化、RT-PCR和ELISE法检测白细胞介素（IL-6）和IL-17A在DLBCL细胞株共培养液或者肿瘤组织中的表达。用流式细胞术来分析Th17和Treg细胞的表达。使用蛋白印迹法、基因芯片分析和生物信息学分析IL-6和IL-17A介导的DLBCL生长的信 通路。以上的分析均采用SPSS进行统计分析。
研究结果表明：

1. hBMSCs分泌IL-6到上清液中，人DLBCL肿瘤组织中IL-6水平高于良性组织。
2. hBMSCs在体内分泌通过分泌IL-6促进DLBCL生长。小鼠的实验中，MSC组合IL-6组的肿瘤体积明显大于对照组；MSC组合IL-6组的IL-6 mRNA合蛋白质的水平明显高于对照组
3. hBMSCs诱导PBMCs分化为Th17和Treg细胞，从而增加共培养上清液中IL-17A和转录生长因子β的水平。hBMSCs显著增加了PBMCs中Th17和Treg细胞的比例，上调PBMCs中RORγt、FOXP3、IL17A和TGF-β mRNA的相对表达，增加共培养上清液中IL-17A和TGF-β蛋白的水平；包含BMSCs的共培养上清液中IL-6水平均显著升高
4. hBMSCs或IL-6促进DLBCL细胞生长是通过保护其免受自发或药物诱导的凋亡，而IL-17A则强化了这些作用。hBMSCs和外源性IL-6和IL-17A促进SU-DHL-4细胞的增殖，而aIL-6和aIL-17A则消除了这些作用；hBMSCs、IL-6或IL-17A降低了自发或利妥昔单抗诱导的SU-DHL-4细胞的凋亡，而aIL-6和aIL-17A则消除了这些作用。
5. IL-6或hBMSCs上调p-JAK2和p-STAT3激活JAK2/STAT3信 通路促进DLBCL细胞的生长。IL-6显著促进SU-DHL-2和SU-DHL-4细胞中p-JAK2和p-STAT3，而aIL-6则消除了这些作用；同样，同样，hBMSCs上调了SU-DHL-4细胞中的p-JAK2和p-STAT3，而aIL-6消除了这些作用。
6. IL-17A上调细胞周期蛋白D2激活PI3K/Akt信 通路促进DLBCL细胞的生长。
   综上，hBMSCs有“双重作用”，即分别通过直接分泌IL-6和间接提高IL-17A水平来促进DLBCL细胞的生长。

前言

8. 介绍DLBCL：非霍奇金淋巴瘤是起源于淋巴结或其他淋巴组织的恶性肿瘤，近十几年来其发病率不断升高。弥漫大B细胞淋巴瘤是其中最常见的亚型，约占30%-40%，全世界范围内一年发病率超过10万例，是一种侵袭性淋巴瘤。根据不同的免疫表型，DLBCL分为两种预后不同的基因亚型，分别是生发中心型（GCB型）和非生发中心型（non-GCB），其中Non-GCB型比GCB型预后差。虽然近些年以来的一线化疗方案（R-CHOP）改善了DLBCL患者的预后，但是仍然有相当一部分患者因化疗耐药而出现进展或复发。有研究 道30%的DLBCL病例对利妥昔单抗或利妥昔单抗为基础的化疗方案耐药，60%的以前对利妥昔单抗敏感的淋巴瘤病人再次接受治疗时出现利妥昔单抗耐药，这是困扰临床治疗的一大难题及挑战。
9. IL-6的研究进展
10. Th17和Treg细胞的研究进展：naive CD4+ T cells在TGF-β和IL-6的共同作用下，经过STAT3通路活化ROR γ t分化为Th17细胞，Th17细胞分泌IL-17和IL-21等多种细胞因子，具有较强的促炎证炎症的作用。初始CD4+ T cells在单独TGF-β的作用下活化Foxp3而分化Treg细胞，Treg细胞分泌IL-10、IL-4和TGF-β，对效应T细胞具有抑制作用。

材料和方法

实验试剂与材料

人体样本和细胞株

人体病理组织样本的收集

石蜡包埋的组织

DLBCL肿瘤组织的样本

胃肠DLBCL 反应性增生的淋巴结的样本

人体外周血单个核细胞样本的收集与培养

①抽取健康志愿者外周血10ml（注意使用肝素抗凝管），然后用10mlPBS稀释。
②15ml离心管中加入5ml的淋巴细胞分离液，然后将稀释后的血样品平铺到分离液上方，注意动作轻柔，两界面应清晰，三者等比例体积分布
③室温，水平转子700-800g，离心20-30min
④离心结束以后，管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆/组织匀浆层，血浆层与分离液层之间是一层致密的白膜，即单个核细胞层。吸取白膜层到15ml的离心管中，然后用PBS稀释以后混匀（白膜层：pbs=1:3）,室温下离心（水平转子250g，10min）
⑤弃上清，5mlPBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min
⑥重复步骤⑤
⑦弃上清，细胞重悬备用。

免疫组化

本研究中使用免疫组织化学方法（IHC）检测48例人肿瘤组织、18例良性组织和24例小鼠组织中IL-6表达水平。实验步骤如下：

细胞凋亡的检测

采用Annexin V/propidium iodide的法检测DLBCL细胞凋亡。将细胞接种于48孔培养板上，用/不用化疗药物培养72h，培养以后用冷的PBS洗涤两次，再悬浮于浓度为1*10⁶细胞/ml的结合缓冲液中，100μl的溶液转移到5ml的试管中，加入5μl Annexin V-FITC和5μl的propidium iodide。试管轻轻的旋转，在室温下在黑暗中国孵育15min。培养结束时，加入300μl的结合缓冲液。立即用流式细胞仪进行流式细胞分析。

人类基因表达谱分析以及生物信息学的分析

SU-DHL-2（2*10⁶细胞/ml）与IL-17A（100pg/ml）共培养72h，后被收集起来。用TRIZOL试剂提取每一个样品的总RNA，测定RNA表达谱，筛选DEGs

异种移植小鼠模型

实验采用雄性裸鼠（BALB/c，20-30g）6-8周龄。在干净的条件下，将小鼠安置在微型的隔离笼中进行检测。所有实验程序和方案均获得广州市第一人民医院动物管理和使用委员会的批准。将SU-DHL-4细胞（110⁷cells/100μl PBS）皮下接种于裸鼠右侧翼，3mm直径肿瘤发生以后将小鼠随机分为三组（每一组8只）。MSC组（510⁵细胞/100μl PBS）；IL-6组（10μg/kg/次）；对照组（100μl/次）。所有组每三天注射一次，总共5次（第0、3、6、9、12）.每3天测量一次肿瘤大小，直到注射hBMSCs、IL-6和PBS后28天。肿瘤体积按照以下公式进行计算：肿瘤体积（mm³）=(a²b)/2,其中a代表短轴的长度，b代表长轴的长度。在hBMSCsIL-6和PBS注射后28天处死小鼠，切除肿瘤并制备IHC，qPCR和WB分析。

统计分析

对于基因芯片分析来说，使用p值阈值和FDR确定DEGs，以及p

实验结果

hBMSCs在体外促进DLBCL细胞的生长，而PBMCs则增强这些作用。

为了研究hBMSCs在体外是否促进DLBCL细胞的生长，将hBMSCs与SU-DHL-2或SU-DHL-4细胞以不同比例在直接或间接的体系中共培养72h，然后在不同的时间点用CCK-8检测SU-DHL-2和SU-DHL-4细胞的h BMSCs在直接（图1A-C）或间接（图1D-F）共培养系统中

6. DLBCL异种移植BALB/c裸鼠模型
7. MSC和IL-6组的肿瘤体积明显大于对照组（图3B）
8. MSC组和IL-6组的IL-6 mRNA和蛋白质水平明显高于对照组

IL-17A上调细胞周期蛋白D2激活PI3K/Akt信 通路促进DLBLC细胞生长

14. 进一步研究IL-17A介导的DLBCL细胞生长的分子机制，我们结合qPCR、western blotting和基因芯片、生物信息学分析一起，以评估相关基因和蛋白质的表达
15. SU-DHL-2细胞样本与IL-17A共培养72小时，另外三个没有IL-17A的样本作为对照.
16. 288个DEGs（139个上调，149个下调）
17. 所有上调的DEGs中的前10个最丰富的生物过程GO条款为 positive
    regulation of cyclin-dependent protein serine/threonine kinase activity、positive
    regulation of cyclin-dependent protein kinase activity、regulation of cyclin-dependent
    protein serine/threonine kinase activity
18. 上述其中三个条款与细胞周期调节有关，参与上调的DEGs分别为PKD1、CDKN1B和CCND2
19. 下调的DEGs中的最丰富途径包括Ras信 通路和p53信 通路
20. 上调DEGs中的最丰富途径包括PI3K/Akt信 通路、Rap1信 通路、前列腺癌和肿瘤microRNAs
21. PI3K/Akt信 通路（8个相关基因：CCND2、CDKN1B、CSF1、EFNA3、FGFR2、FGFR3、IL2RB和ITGA9）在上调的通路中排名第一
22. STRING数据库和Cytoscape 3.6.0软件生成所有相互作用的DEGs的共表达 络，以识别可能在IL-17A介导的SU-DHL-2细胞生长中起重要作用的基因
    10.qPCR检测8个基因的m RNA表达，用western blotting检测PI3K/Akt通路相关蛋白的表达。与基因芯片结果一致，IL-17A处理的SU-DHL-2细胞的CSF1、CCND2、EFNA3、FGFR2、FGFR3、IL2RB和ITGA9的相对mRNA表达显著较高。IL-17A上调了SU-DHL-2细胞中p-Akt和cyclin D2的表达，而aIL-17A则消除了这些影响

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