【文献阅读2】Cytological and transcriptome analyses reveal abrupt gene expression for meiosis and sacchari

Cytological and transcriptome analyses reveal abrupt gene expression for meiosis and saccharide metabolisms that associated with pollen abortion in autotetraploid rice.pdf
分子遗传学和基因组学（2018年）
细胞学和转录组分析显示同源四倍体水稻花粉败育与减数分裂和糖代谢的突然基因表达
摘要：
同源四倍体水稻是一种有用的种质，具有四个染色体组和强大的生物学优势;然而，低生育率限制了其商业利用。关于同源四倍体水稻低生育力的DNA变异和差异基因表达的信息很少。在本研究中，通过全基因组重新测序，与E249（二倍体对应物）相比，在T449（具有低生育力的同源四倍体水稻品系）中鉴定了81个SNP和182个InDel。我们仅检测到三个非同义SNP和六个大效InDel，它们分别与三个和六个基因相关。在减数分裂阶段通过转录组分析共检测到75种减数分裂相关的差异表达基因，包括对减数分裂DSB形成必不可少的OsMTOPVIB，以及参与同源染色体配对和突触的OsMOF。在T449中观察到中期I大约20.69％的滞后染色体和4.65％的异常四分体。此外，转录组分析显示在单个小孢子阶段T449中蔗糖转运蛋白（OsSUT5）和两个单糖转运蛋白（OsMST1和OsMST8）的下调，并且通过qRT-PCR验证它们的表达水平。糖分布的细胞学观察显示T449中糖的异常积累，并且在单个小孢子期，T449中的果糖和葡萄糖含量显着高于E249。我们的研究结果表明，多倍体不仅诱导减数分裂相关基因的突然表达变化，导致染色体行为异常，而且还引起糖相关基因的糖分布和表达模式的变化，这共同导致同源四倍体水稻的不育。
关键词：
同源四倍体水稻·花粉发育·碳水化合物代谢·糖类转运蛋白·减数分裂
介绍：
全基因组复制（WGD）或多倍体在植物进化中发挥了重要作用。由于基因表达模式的变化和遗传变异的增加，环境变化或压力增加了多倍体的短期适应性潜力（Wendel 2000; Soltis等人2009; Van de Peer等人2017）。植物中有两种主要类型的多倍体：异源多倍体和同源多倍体。异源多倍体起源于不同物种的染色体组的重复，这是植物进化的主要途径，可能具有生存优势，因为不同的染色体组是新环境中适应性成功的关键决定因素（Soltis等人2009; Paun等人） .2011; Van de Peer等人，2017）。自体多倍体涉及物种内的全基因组重复，这比单独的分类学更为普遍，并且已经成为植物多样性的重要元素（Soltis等人2007; Van de Peer等人2017）。多倍体物种广泛存在于植物中，并且比其祖细胞具有更高的经济和抗性重要性（Gebhardt和Valkonen 2001; Barker等人2016; Van de Peer等人2017）。同源四倍体水稻比二倍体水稻具有强大的生物学优势，例如巨大的营养器官，高产潜力和广泛的适应性（Shahid等，2011，2012; Tu等，2014; Yang等，2014）。然而，低生育力是同源四倍体水稻利用的主要障碍（He等，2011a; Shahid等，2013a; Wu等，2015; Li等，2017）。为了提高同源四倍体水稻的育性和产量，研究该生物体中的花粉发育及其分子机制至关重要。
部分花粉不育是同源四倍体水稻低育性的主要原因（Shahid等，2010; Li等，2016）。先前的研究表明异常染色体行为和异常微管组织是同源四倍体水稻花粉败育的主要原因（He等，2011a，b; Wu等，2014）。转录组分析表明，多倍体增强了花粉不育基因座的多等位基因相互作用，并增加了同源四倍体水稻的染色体异常（Wu等，2015）。此外，小RNA测序表明，花粉和胚囊的部分不育性是由同源四倍体水稻中特异性差异表达的miRNA引起的（Li等，2016,2017）。开发了多倍体水稻的两个光周期和热敏核不育系（PS006和PS012），它们的杂种表现出很大的杂种优势，并且提高了水稻品质和生产力的巨大潜力（Zhang et al.2017）。
新一代测序广泛用于基因组测序，转录组测序，小RNA测序，染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）和DNA甲基化测序。基因组重组技术是检测遗传变异的有效方法（Han和Huang 2013），其在QTL作图，标记辅助基因组选择和单倍体类型分析中起重要作用（McCouch等人，2010）。全基因组关联研究（GWAS）主要集中在使用全基因组重测序分析与抽穗期和谷粒相关性状相关的基因（Huang等，2012）。傅等人。 （2016）在两个籼稻中鉴定了许多SNP和InDels
（RGD-7S和Tai Feng B）通过对两个水稻品种进行重新测序获得DNA多态性标记。 RNA转录技术（RNA-seq）是了解差异表达基因和植物中阶段特异性基因表达模式的有用工具。 RNA-seq已应用于检测二倍体水稻中非生物胁迫下的差异表达基因（Jin等人2013; Fu等人2017）。此外，与花粉发育过程中的二倍体水稻相比，RNAseq也被用于鉴定同源四倍体水稻中的差异表达基因（Wu等人，2014）。郭等人。 （2017）通过RNA-seq在新四倍体水稻杂种中检测到许多与育性和杂种优势相关的基因。然而，与二倍体水稻相比，同源四倍体中几乎没有关于全基因组DNA变异与RNA-seq结合的信息。检测同源四倍体水稻品系（T449）与其二倍体水稻（E249）之间的基因组变异，这是一个着名的二倍体水稻品种，在Sa和Sb花粉不育基因座上含有双中性基因，S5n基因可以克服籼粳杂种使用高分辨率技术对无菌性（Shahid等人，2013b）进行重新测序。在我们的实验室中，T449已超过25代自交，并具有稳定的农艺性状。此外，染色体行为和组织学观察用于研究T449和E249中的花粉发育。在减数分裂和单个小孢子阶段期间还进行花药发育的转录组分析以检测T449和E249之间的差异表达基因（DEG）。本研究计划（1）观察花粉发育过程中同源四倍体水稻的染色体行为和糖分布，以及（2）检测可能与同源四倍体水稻低花粉育性相关的基因。我们发现减数分裂和糖相关基因的表达模式的突然变化导致同源四倍体水稻的低生育力。
材料和方法：
水稻材料：
在该研究中使用同源四倍体水稻品系（T449）及其二倍体对应物（E249）。 T449是从E249开发的，通过秋水仙碱处理，并在我们的农场进行了超过25代的自交。所有材料均在自然条件下在华南农业大学（SCAU）实验农场种植，管理实践遵循该地区的建议。
观察染色体行为和花粉育性
根据Wu等人观察到染色体行为。 （2014）。从水稻植株的枝条中收获T449和E249的小穗，它们的旗叶垫和倒数第二个叶垫之间的距离为2至4厘米，并固定在Carnoy溶液（乙醇：乙酸= 3：1）中24小时。 H。洗涤后，将样品在4℃下储存在70％乙醇中。使用解剖针和镊子从小花中解剖花药，并将其压扁并置于玻璃载玻片上的1滴乙酸胺中。 1-2分钟后，用载玻片覆盖载玻片并在显微镜下观察（Motic BA200）。花粉育性通过正常和异常花粉粒的比例来估计，其通过在显微镜下用1％I2-KI染色（Motic BA200）观察到。正常花粉被完全染色，而异常花粉可根据染色和花粉形态分为两种类型，包括染色的流产花粉和空的流产花粉。染色的流产花粉比正常的花粉小或没有完全染色，空的流产花粉比正常的花粉小，并且是空的或无色的（Zhang和Lu 1989）。
组织学观察：
根据制造商的方案（Heraeus Kulzer）收获，固定，脱水并包埋在Leica 7022 Histeresin包埋试剂盒（7022LR）中的T449和E249的花药。用切片机（Leica RM2235）切割1-2μm厚的切片，并在60℃下干燥24小时。切片用0.5％高碘酸（m / v）和Schiff试剂[0.05％碱性品红（m / v），0.05％偏亚硫酸氢钠（m / v）和10％HCl（v / v）]染色，最后用0.05％甲苯胺蓝（m / v）（Feder和OBrien 1968）。使用显微镜（Motic BA200）观察并拍摄花药切片。
花药中糖类含量的测定：
收集减数分裂和单个小孢子阶段的T449和E249的花药，以使用DAPI荧光染色法确认花粉发育阶段（表S1）。将500mg新鲜花药样品在110℃下在烘箱中风干15分钟，并在相同的烘箱中在65℃下保持12小时。用80％乙醇水溶液提取50mg干燥花药样品，然后置于80℃的热水浴中40分钟。将样品以4000rpm离心10分钟并除去上清液。重复相同的过程两次，收集上清液。将活性炭加入到上清液中，在80℃下脱色10分钟，并将体积调节至5ml。最后，将混合的上清液过滤并制备以使用购自苏州科明生物工程公司（中国苏州科明生物工程公司）的试剂盒测量果糖，葡萄糖和蔗糖的含量。所有测量一式三份进行。
全基因组重测序分析：
使用改良的CTAB方法（CotaSanchez等人，2006）从幼叶中提取E249和T449的基因组DNA。该库根据制造商的方案制备。基因组重测序在Illumina Hiseq 2500平台（Biomarker Technologies，Beijing，China）上进行。该程序根据标准Illumina方案进行。使用FastQC评估生成的FASTQ文件质量（http：//www.bioin forma tics.babra ham.ac.uk/proje cts / fastq
C/）。取出低质量的读数[用测序衔接子读取，含有超过10％N的读数，读取含有超过50％的低质量碱基（<10）]，然后将过滤后的高质量读数映射到使用BWA软件的Nipponbare参考基因组。通过GATK软件检测SNP和InDel，并检测SNP的碱基突变，相应染色体的物理位置，小InDel的大小和相应染色体上的位置。使用FREEC软件识别拷贝数变异（CNV），断点阈值为0.8（窗口= 50,000），而其他参数设置为默认值。使用SnpEff软件注释SNP和InDel，并且基于Nipponbare参考基因组的GFF文件注释CNV。
验证SNP和InDels：
基于重新测序结果，随机选择38个SNP和InDel进行验证。使用Primer Premier 5.0设计寡核苷酸引物，产物长度范围为400-800bp（表S2）。使用E249和T449的基因组DNA作为模板通过聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA。 PCR过程为94℃5分钟，然后进行35个循环：95℃45秒，55℃45秒和72℃1分钟，最后在72℃延伸5分钟。通过Sanger测序对PCR产物进行测序，并使用ClustalW软件进行序列比对。
RNA提取和RNA-seq实验：
在减数分裂和单个小孢子阶段从花药中提取总RNA。将所有样品收集在三个生物学重复中并在-80℃下储存用于RNA沉淀。根据TRIzol试剂（Life technologies，California，USA）的手册说明从每个样品中提取总RNA。该库根据制造商的方案制备。 RNA-seq在Illumina HiSeq 2500测序平台（Biomarker Technologies，Beijing，China）上进行。使用Illumina配对末端RNA-seq方法，我们对产生数百万个配对末端读数的转录组进行了测序。取出低质量读数（接头序列，未知核苷酸> 5％，或Q20 <20％[测序错误率<1％的序列的百分比]]。使用具有默认参数的Bowtie2和Tophat2软件将从原始读数中过滤的清洁读数映射到Nipponbare参考基因组上。进一步检查来自BAM / SAM格式的对准器的对齐记录，以消除可能的重复。使用DESeq包（Anders和Huber 2010）检测样品之间的基因表达差异。每千碱基的片段（每百万片段映射的转录物的FPKM）值用于估计基因表达水平（Trapnell等人，2010）。错误发现率（FDR）用于确定多次测试中p值的阈值。使用FDR≤0.05和log2的绝对值（倍数变化）≥1，将基因用于后续分析。
RNA-seq数据的统计分析
在归一化之后使用Cluster 3.0软件执行分层分析。 Venny软件用于鉴定不同样品中重叠的差异表达基因（http：// bioin fogp.cnb.csic.es/tools/venny/）。转录因子数据从数据库DRTF下载（Jin等人，2017）。使用植物GeneSet富集分析工具包（http：// struc tural biolo gy.cau.edu.cn/Plant GSEA /）和AgriGO工具（http：/）对基因本体（GO）富集分析进行差异表达基因的功能分类。 / bioin fo.cau.edu.cn/agriG O /）。
Statistical analysis of RNAeq data
Hierarchical analysis was performed using Cluster 3.0 software after normalization. Venny software was used to identify the overlapped differentially expressed genes in different samples (http://bioin fogp.cnb.csic.es/tools /venny /). Transcription factor data were downloaded from the database DRTF (Jin et al. 2017). Gene ontology (GO) enrichment analysis was employed for functional categorization of differentially expressed genes using the Plant GeneSet Enrichment Analysis Toolkit (http://struc tural biolo gy.cau. edu.cn/Plant GSEA/) and AgriGO tool (http://bioin fo.cau. edu.cn/agriG O/).

实时qRT-PCR分析
通过qRTPCR选择总共18个进行验证。使用Primer Premier 5.0软件设计基因特异性引物（表S3）。总RNA取自
测序样品，并使用PrimeScript TM II第一链cDNA合成试剂盒（TaKaRa）根据制造商的说明合成第一链cDNA。使用具有gDNA Eraser（TaKaRa）的Prime Script RT试剂盒，在Lightcycler480系统（Roche）上进行qRT-PCR。 qRT-PCR反应条件在95℃下为30秒，进行40个循环的95℃变性5秒和60℃退火并延伸20秒。使用2-ΔΔCt方法（Livak和Schmittgen 2001）计算基因的相对表达水平。所有qRT-PCR反应一式三份进行。
数据可用性
所有数据均以登录 PRJNA436888提交至NCBI序列读取存档数据库。
结果
同源四倍体水稻的特征（T449）
主要农艺性状（图1）在T449和E249之间检测到明显差异，包括株高，粒长，粒宽，千粒重和穗长，但旗叶长度和穗长无显着差异。宽度（表1）。 T449的粒长，粒宽和千粒重显着增大，株高和有效穗数显着低于E249（表1和图1）。此外，在T449中发现了染色的流产和空的流产花粉（图1），T449中的花粉育性和结实率分别为54.09和34.47％，显着低于E249（表1）。这些结果表明，T449比其二倍体对应物具有明显的生物量优势，并且在农艺性状上显示出显着差异。
图1同源四倍体（T449）和二倍体水稻（E249）的植株类型，粒形和花粉育性。植物外观为T449和E249，b颗粒形状为T449和E249，bar = 1 cm。通过用1％I2-KI染色观察到E249（c）和T449（d）的花粉育性。蓝色箭头表示染色的流产花粉，绿色箭头表示空的流产花粉，红色箭头表示正常的花粉。棒=100μm。 （彩色图在线）