图解三代测序（Nanopore）

一、测序原理

先介绍 Nanopore 测序中的几位主角：

：在自然界中，有一种可以嵌入到细胞膜中作为离子或分子通道的跨膜蛋白，具有天然的蛋白纳米孔。经过人为基因工程修饰后，得到的就是 Nanopore 测序所需的 Reader 蛋白。

：在 Nanopore 文库构建时，需要在接头上连接一种动力蛋白，用于将DNA或RNA分子推入纳米孔中。以DNA解螺旋酶作为 Motor（动力蛋白）为例，它可以除了可以解开双螺旋，使之变为单链，还可以提供推动力。

这时，解开的其中一条链会穿过蛋白质孔，它在通过蛋白孔时，会对膜两边离子的稳定流动产生扰动。不同的碱基，对离子流的影响不同，也就会产生不同的电流大小，进而形成下面的电流信 图。

这里边，最著名的就是MnION系列，2016年8月，美国宇航员凯特·鲁宾斯在国际空间站完成微重力条件的DNA测序。

它在测序时，一般像下图这样连接就行，显而易见的便携性。比如，可以直接用它在深入疫区采集样本后进行实时分析，为防疫工作争取大量宝贵的时间和资源。

一张芯片中有 2048 个 membrane wells，也就是芯片上的一个孔，每个孔包含一个nanopore Reader。

在启动测序仪后，机器自检，会将每组 wells 中依据效率高低排序。测序开始，仪器先用每组 wells 中效率最高的 wells，运行 8 小时后，更换效率第二的，以此类推。

但是，在实际使用过程中，只有 1200 个 wells可以正常工作。

造成 wells 失效的原因：

• wells 中没有 Reader 蛋白，或纳米孔不通，这时无电信
• 膜破损，这时有强电信 ，不能正常测序
• 在单个 well 中有两个及以上的 Reader 蛋白，电信 互相干扰

三、建库方法

1、1D 文库

1D文库是将DNA双链，解链为正义链与反义链，分别测序，大约有 85% 的碱基判读准确率。

目前有两种建库方案：

标准建库

• 将 DNA 打断
  

• 连接 Adapter（ 接头序列），接头上连有 Motor 蛋白
  

  下图是 Tether 与接头序列识别及锚定过程
  

• 由于该酶的特性，会在DNA的断点两端加接头序列
  

2、 1 D 2 1D^2 1D2 文库

在 DNA 两侧接 1 D 2 1D^2 1D2 接头，其他步骤和 1D 文库类似。

这种文库中的 1 D 2 1D^2 1D2 接头，可以让第二链紧跟第一链来一起测序。

由于可以测到两条链，可以相互矫正，进而提高判读准确率，能达到 90%以上的碱基判读准确率。

总结

• Nanopore 测序是基于电学的检测，区别与 Illumina 和 PacBio 的光学
• 测序仪器便携，可用于远离实验室的地区，如疫区，农场等
• 读长较长，大约 300,000 ~ 400,000 个碱基，可用于从头组装基因组，可变剪切等
• 可以对DNA ，RNA，甚至蛋白质序列进行测序
• 碱基判读准确率较高，R10纳米孔数据质量值超过Q40（错误率0.01%），一致性（Identity）质量值达Q50。

参考：

https://www.youtube.com/watch=RcP85JHLmnI

https://www.youtube.com/watch=E9-Rm5AoZGw&t=13s

https://www.youtube.com/watch=sv9fFeSd3kE

https://nanoporetech.com/