导语

• Hi-C是高通量染色体构象捕获（High-throughput Chromosome Conformation Capture, Hi-C）技术的简称，开发于2009年，最初用于捕获全基因组范围内所有的染色质内和染色质间的空间互作信息，目前已应用于基因表达的空间调控机制研究、构建染色体水平参考基因组、构建单体型图谱等。

• Hi-C技术源于染色体构象捕获（Chromosome Conformation Capture, 3C）技术，利用高通量测序技术，结合生物信息分析方法，研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系，获得高分辨率的染色质三维结构信息。Hi-C技术不仅可以研究染色体片段之间的相互作用，建立基因组折叠模型，还可以应用于基因组组装、单体型图谱构建、辅助宏基因组组装等，并可以与RNA-Seq、ChIP-Seq等数据进行联合分析，从基因调控 络和表观遗传 络来阐述生物体性状形成的相关机制。

3C，4C，5C以及HiC测序技术

利用甲醛对样本进行交联，质检合格后使用限制性内切酶（如MboI等）进行酶切，酶切片段经生物素标记、平末端连接、DNA纯化提取，超声打断后钓取含有生物素的片段，进行建库测序。

随后，对原始下机数据进行质控，并将质控截取后的Clean reads与参考基因组比对，获得用于互作分析的Valid reads。由于Hi-C文库的构建具有一定的复杂性，在实际的项目执行过程中，会先通过对小规模的测序数据进行评估，以检测所构建文库的质量。小数据评估合格后，启动大数据的上机测序，以保证测序数据的质量。

Hi-C技术的大致流程

1. 通过甲醛交联固定，将细胞内由蛋白质介导的空间上邻近的染色质片段进行共价连接。

2. 限制性内切酶进行酶切

3. 使用生物素标记末端标记

4. 将连接的DNA纯化后超声打断，并用生物素亲和层析，将生物素化的DNA片段分离，加上接头进行高通量测序

Hi-C建库测序流程

1. 输入包括一组来自草稿装配的contigs (or scaffolds) 和一组全基因组染色质相互作用数据，例如Hi-C links。

2. 与不同染色体上的contigs相比，同一染色体上的contigs之间往往有更多的Hi-C links。LACHESIS利用这一点将contigs聚集成与个体染色体基本一致的群体。

3. 在一条染色体内，近在咫尺的contigs往往比相距遥远的contigs有更多的联系。LACHESIS利用这一点来排列每个染色体组内的contigs。

4. 最后，LACHESIS利用相邻contigs之间连接的精确位置来预测每个contigs的相对方向。

LACHESIS的输入包括一组contigs or scaffolds以及一组全基因组染色质相互作用数据集
在第一步中，LACHESIS利用Hi-C数据集中染色体内接触平均比染色体间接触更可能的事实，利用层次聚集聚类对可能来自同一染色体的contigs进行分组。该聚类使用平均连锁度量，连锁定义为连接任何给定一对重叠的Hi-C读对的标准化密度。groups的最终数目是预先指定的，理想情况下设置为预期的染色体数目。

在第二步中，LACHESIS利用较高的Hi-C links，在每个染色体组内线性排列重叠序列。对于每个染色体组，用表示重叠的顶点和对应于重叠对之间偶合对之间的标准化Hi-C连锁密度构建一个图。

在第三步中，通过精确地计算Hi-C在每个contigs上的位置，确定contigs的方向。
For each chromosome group, a weighted, directed, acyclic graph is built representing all possible ways to orient the contigs, given the predicted order.

HiC-Pro

HiC-Pro是一款高效的Hi-C数据分析软件，提供了从原始数据到归一化之后的HI-C图谱构建的完整功能，运行效率高，用法简便。
完整的pipeline如下图所示：

构建原始Hi-C图谱

根据指定的分辨率，统计两个bin区域内valid pairs的数目, 去除PCR重复之后，构建原始的交互矩阵。

归一化

不同区域GC含量，mapping概率等系统误差都使得原始的交互矩阵不能够有效代表染色质交互信息， 所以需要进行归一化。采用了一种迭代校正的归一化算法对原始的交互矩阵进行归一化，矫正系统误差。

ALLHiC

ALLHiC一共分为五步:pruning, partition, rescue, optimization, building

1. prune 步骤去除了等位基因之间的联系，因此同源染色体更易于单独分离。

2. partition 功能将修剪的bam文件作为输入，并根据Hi-C建议的链接对链接的contigs进行聚类，大概是沿着相同同源染色体在预设数量的分区中进行。

3. rescue 功能从原始未修剪的bam文件中搜索分区步骤中不涉及的contigs，并根据Hi-C信 密度将它们分配给特定的群集。

4. optimize 步骤采用每个分区，并优化所有contigs的顺序和方向。

5. build 步骤通过连接contigs来重建每个染色体

如下图所示：

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