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重要通知：
Western Blot实验有非常多的注意事项，只要把细节控制好就能得到漂亮的图。
【全程剖析Western blot原理，你才能掌控它。 】
【血泪教训，Western blot最全避雷手册。 】
【 干货 ▎Image J分析Western Blot蛋白条带灰度值 】
Western Blot实验的最后环节是查看曝光后的蛋白条带图，在 蛋白表达丰度很高或很低，用肉眼很难评价蛋白条带 是否过曝或曝光不足。
（图片来自 络）
为什么要如此强调曝光程度呢？
蛋白条带半定量分析的本质是在0-255范围内定量检测条带的灰度值。
（1）如果 曝光时间足够长，所有组别的条带灰度值都会趋近255（不会超过255）。如此一来，组间灰度值的差异可能因为曝光时间过久而被人为灭失，也就是 假阴性。
（2）如果 曝光时间太短，荧光未充分发出，此时组间的差异可能并非真实情况，而是曝光度不足形成的，条带变成什么样都有可能，灰度值也是不可信的，也就是 假阳性。
最好的蛋白条带是在合适的曝光条件下获得的。这个合适就很耐人寻味了！
为了拿到准确的实验结果或及时调整实验条件（如抗体浓度、曝光时间等），很有必要对蛋白条带曝光程度进行分析。
只需半分钟即可做到！
图文步骤
1.打开Image Pro Plus，打开一张曝光后的蛋白条带灰度图。
2.点击measure，选择Line Profile。
3.在弹窗中按照如下设置，共4个要点。
4.此时，条带图中会出现两条平行线。将线条拉长，使得平行线夹住目标条带。
5.此时，再来看右侧的波形图。
波形分析：
纵坐标轴最高为250（灰度值上限为255）。可以看到所有波峰（即目标条带）都超过了200，较多条带灰度值逼近250；所有波谷均在150以上，说明条带背景也稍强。
这种情况下，说明条带曝光时间稍长。如果再次进行WB实验，在其它条件不变的情况下，需要适当减短曝光时间。
大致原理如此，希望各位实验顺利。
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